植物细胞的活体染色与死活鉴定

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【原理】
活体染色是利用某种对植物 无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4~8.0之间(由红变黄)。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应。因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核 结合，而使原生质与细胞核染色。
【仪器与用具】
显微镜；小培养皿；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；擦镜纸；吸水纸适量。
【试剂】
0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液。
　　【方法】
　　1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部）及小麦叶片作材料。
　　2.切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内侧向下）。若用小麦叶片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片上，再将此载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀片从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到只剩下少量叶肉细胞时要十分小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除小麦外其他禾本科植物也可用此法制备表皮细胞，将刮好的材料切成约0.5cm2小块。
　　3.将制好的洋葱鳞茎内表皮或小麦叶片上表皮小块投入0.03%的中性红溶液中染色5～10min，取出1～2片，在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察，可看到细胞壁被染成红色，而原生质和液泡均不染色，这是因为蒸馏水偏酸，在弱酸性条件下细胞壁带负电荷和染料阳离子发生吸附的结果。
4.将步骤3中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10～15min，再置于载玻片上镜检，将发现细胞壁脱色，而液泡却被染成深红色，这是因为在溶液pH高于7.0的情况下，中性红分子 的解离作用很弱，主要以分子状态存在，不易被细胞壁吸附，但较易透过质膜和液泡膜进入液泡，而植物的细胞液多呈酸性反应，进入液泡的中性红于是发生解离，将液泡染成樱桃红色。此时细胞核和原生质不染色。
为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1mol/L的硝酸钾溶液中浸泡10min左右，然后取出观察。由于硝酸钾能使原生质强烈膨胀，发生“帽状质壁分离”，因而能清楚地区别开无色透明的原生质和染成红色的液泡。
　　5.将步骤4中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察，会看到原生质凝结成不均匀的凝胶状，与细胞核一起被染成红色。
6.在活体染色制片中仔细寻找，可能看到个别死细胞，其细胞核因被中性红染色而呈红色，清晰可辨。