植物细胞的活体染色与死活鉴定

一、原理

活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4-8.0之间（由红变黄）。

在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应。因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

二、仪器与用具

显微镜；小培养皿；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；擦镜纸；吸水纸适量。

三、试剂

0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液。

四、方法

1. 选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部）及小麦叶片作材料。

2. 切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内侧向下）。若用小麦叶片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片上，再将此载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀片从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到只剩下少量叶肉细胞时要十分小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除小麦外其他禾本科植物也可用此法制备表皮细胞，将刮好的材料切成约0.5cm2小块。

3. 将制好的洋葱鳞茎内表皮或小麦叶片上表皮小块投入0.03%的中性红溶液中染色5~10min，取出1~2片，在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察，可看到细胞壁被染成红色，而原生质和液泡均不染色，这是因为蒸馏水偏酸，在弱酸性条件下细胞壁带负电荷和染料阳离子发生吸附的结果。

4. 将步骤3中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10~15min，再置于载玻片上镜检，将发现细胞壁脱色，而液泡却被染成深红色，这是因为在溶液pH高于7.0的情况下，中性红分子的解离作用很弱，主要以分子状态存在，不易被细胞壁吸附，但较易透过质膜和液泡膜进入液泡，而植物的细胞液多呈酸性反应，进入液泡的中性红于是发生解离，将液泡染成樱桃红色。此时细胞核和原生质不染色。

为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1mol/L的硝酸钾溶液中浸泡10min左右，然后取出观察。由于硝酸钾能使原生质强烈膨胀，发生“帽状质壁分离”，因而能清楚地区别开无色透明的原生质和染成红色的液泡。

5. 将步骤4中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察，会看到原生质凝结成不均匀的凝胶状，与细胞核一起被染成红色。

6. 在活体染色制片中仔细寻找，可能看到个别死细胞，其细胞核因被中性红染色而呈红色，清晰可辨。