葡聚糖凝胶层析脱盐

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一. 目的
学习凝胶层析的工作原理和操作方法
掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术
二. 原理
凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱 。
1. 层析介质的特点
（1）遇水为不溶解的固相； （2）是化学惰性物质；
（3）离子基团含量少； （4）颗粒大小和网眼均匀；
（5）机械强度较强； （6）具有可选择的多种孔径。
目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂 糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶（商品名称Sephadex）是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷（ ）交联成的具有三维结构不溶于水的高分子 化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。当葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定（参见附录五）。
2. 分离原理
当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。
当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25（或G-15、G-50），用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。
三. 实验材料及设备
1. 材料
含硫酸铵盐的蛋白质溶液
2. 器材
层 析 柱： 内径×柱高=1.0cm×25cm
滴定台架、螺丝夹：各1
刻度试管： 10mL×14
移 液 管： 1mL×1
烧 杯： 250mL×1 50mL×1
滴 管： 2
洗 耳 球： 2
洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1
四. 试剂的配制
1. 葡聚糖凝胶Ｇ-25(或G-15、G-50)
溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复3～4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。
2. BaCl2溶液（1%）
3. 考马斯亮蓝G-250
称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。
4. 脲（6mol/L）
5. 洗脱剂
应依据被纯化的蛋白质的不同特性而选用不同的缓冲液。