抗原-葡聚糖和抗鼠1g-葡聚糖进行纯化

最新修订时间：2024-05-13

原理

当所希望制备的抗体不能与葡萄球菌蛋白A有效地结合时（如IgM和一些IgG1抗体），可以用亲和层析柱来进行制备，柱子装填的介质是偶联上蛋白抗原或者抗鼠Ig的CNBr活化葡聚糖。这种抗原-葡聚糖将用于分离特异性的抗体，而抗鼠 Ig-葡聚糖用于分离所有的鼠免疫球蛋白。

材料与仪器

腹水（单克隆抗体）
CNBr 活化葡聚糖 4B (Amersham Pharmac1a B1otech) 1 mmol L HCl 偶联缓冲液蛋白质抗原或抗鼠Ig的抗体（可购买获得） 1 mol L 乙醇胺 pH 8.0 的 PBS 洗涤缓冲液 60 mL或者150 mL的玻璃砂芯漏斗中等孔径。

步骤

1)将3.3 g CNBr活化葡聚糖4B溶胀于1 mmol/L HCl中（可得10 mL溶胀的凝胶），然后转移至玻璃砂芯漏斗中，并用：（a) 200-500 mL 的1 mmol/L HCl； (b) 200- 500 mL偶联缓冲液。依次洗涤>30 min。

2)将葡聚糖凝胶转移至 50 mL 锥形塑料离心管中，加 50-100 mg 的配体（2-5 mg/mL), 混匀后置摇动平台 4℃ 过夜。250 g离心 10 min, 弃上清。

3)加偶联缓冲液至满管，离心，弃上清。

4)加 20-40mL 1 mol/L pH 8.0 的乙醇胺，置摇动平台 4℃ 4-5 h, 离心，弃上清。

5)在管中依次加满 PBS 和洗涤缓冲液洗涤，每次洗后离心。

6)将葡聚糖凝胶转移到一个2.5 cm 的玻璃柱中，用 100 mL 的 PBS 平衡。

7)腹水液稀释于 3 倍体积的 PBS 后上柱，流速为 1-5 mL/min，在室温下操作。

用 30 mL的 PBS 从柱子上洗去未结合的蛋白质。

8)用甘氨酸•Cl 缓冲液洗脱结合蛋白质，分析、浓缩

来源：丁香实验