蛋白等电聚焦凝胶电泳技术

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1.原理：等电聚焦凝胶电泳 是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。
等电聚焦中，只有在凝胶两端给以高电压时，才能获得较好的蛋白质条带分辨率，这就需要非常有效的凝胶冷却系统（否则会导致烧胶），即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高，并可方便的同时比较多种蛋白质样品，所以平板胶用在等电聚焦上的居多。
由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感，若要好的重复性，制备蛋白样品时一定要小心，要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外，蛋白质－脂类、蛋白质－蛋白质相互作用可引起电荷改变，进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质－蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能，等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。
2.主要仪器、试剂。
仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器
试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30％（w/v）丙稀酰胺，1％（w/v）双－丙稀酰胺；2）20％Triton X100；3）10％三氯乙酸；4）1％三氯乙酸；5）1％溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；
3.载体两性电解质的选择
载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子 量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混合物，下面时配置不同pH范围等电聚焦凝胶的载体两性电解质的配方：

pH范围

载体两性电解质pH范围

凝胶中的百分比％

3.5-10

3.5-10

2.4

4-6

3.5-10
4-6

0.4
2

6-9

3.5-10
6-8
7-9

0.4
1
1

9-11

3.5-10
9-11

0.4
2

4.灌胶
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml； 储存液1）：2.0 ml； 载体两性电解质溶液pH3.5-10 48ul； 载体两性电解质溶液pH4-6 240ul； 超纯尿素 6.0 g ；10％过硫酸胺25ul； TEMED：20ul
灌胶步骤：1）组装灌胶器；2）将尿素、水、溶液1）和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4）将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5）插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6）聚合约1小时；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1）上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2）现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
样品制备和上样：
一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15ul。
变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20ul；3）pH4-6载体两性电解质：100ul；4）20％Triton X－100：500ul：5）2－巯基乙醇：50ul；双蒸水：1.7ml；1％溴酚蓝：200ul