蛋白标记技术需要前期准备什么?

做蛋白标记技术(如iTRAQ)来进行差异蛋白质组学分析,主要的前期准备工作包括:

1. 实验设计:确定比较组别,每个组别需要的样本量,重复次数等。

2. 样本收集和处理:收集质量好、含量充足的样本,快速冷冻保存。免疫沉淀或ultrafiltration去除高丰度蛋白。

3. 蛋白提取试验:优化裂解液配方和裂解条件,确保蛋白充分裂解和溶解。

4. 蛋白定量:优化Bradford或BCA蛋白定量方法,确定样品蛋白浓度。

5. SDS-PAGE验证:进行SDS-PAGE电泳,确定各样本蛋白图谱一致性。

6. 酶解条件优化:选择合适的酶,优化酶解时间和温度,获得最佳肽段。

7. 质谱方法优化:优化液相梯度、离子源参数等,获得良好质谱图。

8. 方法重复性验证:重复上述步骤,评估实验重复性。

做好这些前期准备工作,对获得高质量的蛋白标记数据非常关键。

需要准备标记的同位素，利用同位素进行标记区分

1）透析除盐：蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/l NaCl , pH7.0）透析。

（2）去除蛋白质中的沉淀：长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以100000r/min 4℃离心60min取上清液，调整蛋白质浓度至1mg./ml即可用于标记。