二维凝胶电泳质谱技术等电聚焦电泳

互联网2010-12-02

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二维凝胶电泳质谱技术等电聚焦电泳

1. IPG的pH值范围

等电聚焦电泳 (isoelectrofocusing，IEF)目前广泛使用商品化的IPG胶条。其pH值范围的选择一般遵循以下原则：①pH 3一10线性梯度胶适于了解样本中所有蛋白质的分布情况；②pH 3―10非线性梯度胶能提高pH 5―7之间的样本蛋白质解析度；③联合使用pH 4～7和pH 6～11梯度胶可获得相关pH范围的更清晰的蛋白质分布情况；④小pH范围梯度胶(如pH 3．5―4．5，pH 4．5―5．5，pH 5―6等)可提供高分辨率的蛋白质分布图谱。

2．IPG系统主要的蛋白质上样方式

(1)泡涨上样：可以允许低浓度样品上样，有较大的上样量。但因需要泡涨过夜，故蛋白质可能发生溶解或修饰。

(2)杯上样：容易在上样处形成蛋白质沉淀，蛋白质样品易渗漏。但对于pH 6～1l和pH 6～9的碱性胶条可以得到更好的分离效果。

上样重泡涨液一般为相应的提取液+相应的两性电解质(o．5％)+痕量溴酚蓝。

3．胶条水化时间和等电聚焦电泳时间

(1)胶条水化时间：一般为12～14h。

(2)等电聚焦电泳时间：根据胶条的长度及pH梯度范围来确定，经常需要根据经验和实践决定。一般采用逐渐增加电压的方式，?cm胶条需完成8 000Vh到32 000Vh，llcm胶条20 000Vh到48 000Vh，17cm胶条50 000Vh到80 000Vh。等电聚焦电泳时达到设定的伏特小时数所需时间，受样品和缓冲液的影响，也受IPG胶条的pH值范围的影响。如果是更复杂的样品，或者蛋白质数量增多，都需要增加聚焦的伏特小时数。