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二维凝胶电泳质谱技术等电聚焦电泳

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1004
二维凝胶电泳质谱技术等电聚焦电泳
1. IPG的pH值范围
等电聚焦电泳 (isoelectrofocusing,IEF)目前广泛使用商品化的IPG胶条。其pH值范围的选择一般遵循以下原则:①pH 3一10线性梯度胶适于了解样本中所有蛋白质的分布情况;②pH 3―10非线性梯度胶能提高pH 5―7之间的样本蛋白质解析度;③联合使用pH 4~7和pH 6~11梯度胶可获得相关pH范围的更清晰的蛋白质分布情况;④小pH范围梯度胶(如pH 3.5―4.5,pH 4.5―5.5,pH 5―6等)可提供高分辨率的蛋白质分布图谱。
2.IPG系统主要的蛋白质上样方式
(1)泡涨上样:可以允许低浓度样品上样,有较大的上样量。但因需要泡涨过夜,故蛋白质可能发生溶解或修饰。
(2)杯上样:容易在上样处形成蛋白质沉淀,蛋白质样品易渗漏。但对于pH 6~1l和pH 6~9的碱性胶条可以得到更好的分离效果。
上样重泡涨液一般为相应的提取液+相应的两性电解质(o.5%)+痕量溴酚蓝。
3.胶条水化时间和等电聚焦电泳时间
(1)胶条水化时间:一般为12~14h。
(2)等电聚焦电泳时间:根据胶条的长度及pH梯度范围来确定,经常需要根据经验和实践决定。一般采用逐渐增加电压的方式,?cm胶条需完成8 000Vh到32 000Vh,llcm胶条20 000Vh到48 000Vh,17cm胶条50 000Vh到80 000Vh。等电聚焦电泳时达到设定的伏特小时数所需时间,受样品和缓冲液的影响,也受IPG胶条的pH值范围的影响。如果是更复杂的样品,或者蛋白质数量增多,都需要增加聚焦的伏特小时数。
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