二维凝胶电泳质谱技术蛋白质样品的制备

互联网2010-12-02

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二维凝胶电泳质谱技术蛋白质样品的制备

选择正确的样品制备方法是双相电泳实验成功的关键，根据实验设计和研究目的而选择不同的蛋白质样品制备方法。

1．蛋白质样品制备过程中须遵循的基本原则

蛋白质样品制备过程中须遵循的基本原则：①可以重复溶解包括疏水性蛋白质在内的所有蛋白质；②在等电聚焦电泳过程中，避免溶解性低的蛋白质聚积和析出；③减少蛋白质的化学修饰或蛋白质降解；④去除核酸、多糖和脂类等可能产生干扰的大分子物质；⑤有时需去除高丰度或不相关的蛋白质，提高低丰度蛋白质的浓度。

2．蛋白质裂解液的常用成分

蛋白质样品制备的方法多种多样，根据样品性质的不同，可选用具有单一增溶作用的蛋白裂解液，也可选用含有多种离液剂(chaotropicagents)、去垢剂和还原剂的复杂混合裂解液。

绝大多数样品都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的蛋白质提取方法，蛋白质样品中离液剂、去垢剂、两性电解质或还原剂浓度的改变，都会对双向电泳的结果产生影响。

(1)离液剂：可以破坏氢键等次级键，增加蛋白质的溶解性。代表试剂为尿素。硫脲(thiourea)是一种更有效的变性剂，可促进难溶蛋白质溶解，但其在水中的溶解性低，需高浓度尿素的存在，故常用含5～8M尿素和2mol／L硫脲的缓冲液。

(2)去垢剂：破坏蛋白质间疏水作用，增强蛋白质在其等电点值处的溶解性。常用的是兼性离子去垢剂如丙基磺酸盐(CHAPS)。离子型去垢剂如SDS，不适合在等电聚焦电泳时使用。

ASBl4或C8则是两种新型去垢剂，由一个极性的头部和一个大于12个碳原子的碱性尾部组成。由于其头部的极性更强，所以比辛酰基硫代甘氨酸三甲内盐(SB3―10)在分离疏水蛋白时效果更佳。

(3)还原剂：断裂蛋白质分子间的二硫键，使蛋白质处于还原状态，以利肽链分离。二硫苏糖醇(DDT)在碱性条件下常带有电荷，在IEF过程中可能迁移出pH梯度，使某些蛋白质的溶解度降低而聚集沉淀。三丁基磷(TBP)是非离子型还原剂，IEF过程中不会在IPG上迁移，可大大增加蛋白质的溶解度及向第二相转移的能力。

(4)载体两性电解质或固定pH梯度缓冲液(1PGbuffer)：可防止蛋白质通过所带电荷互相聚集，提高蛋白质的溶解度。

(5)蛋白酶抑制剂：

①苯甲基磺酰氟(PMSF)，抑制丝氨酸蛋白酶和部分半胱氨酸蛋白酶。4―(2―氨乙基，苯磺酰氟作用相似于PMSF，但溶解度更好。

②乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双四乙酸(EGTA)，抑制金属蛋白酶。

③肽蛋白酶抑制剂。如亮抑酶肽(1eupeptin)抑制丝氨酸蛋白酶和部分半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂A(pepstainA)抑制天冬氨酸蛋白酶。

④苯甲酰胺抑制丝氨酸蛋白酶。因每种蛋白酶抑制剂仅作用于一类蛋白酶，所以建议联合使用。

3．一步法

一步法提取蛋白常用的裂解液配方为尿素8 mol／L，CHAPS 4％，Tris 40 mmol／L，DDT 50mmol／L，PMSF 0．14％。

4．更有效的蛋白样品制备策略

一步提取法采用单一裂解液和单一的裂解步骤，蛋白质提取效率较低，大约只为总蛋白质的50％左右，于是更有效的蛋白样品制备策略被越来越多的采用。

(1)分步顺序提取：利用不同蛋白质溶解度的差异来达到分离蛋白质的目的。

蛋白质样品通过3种溶解性逐渐增强的溶液被分步抽提，所得到的三部分蛋白质样品分别行二维凝胶电泳。优点在于可以检测出更多的蛋白质斑点，且低丰度蛋白质的浓度得到增强，从而提高了提取效率。分步顺序提取蛋白常用的裂解液配方如下。

分组提取液1：Tris 40mmol／L

分组提取液2：尿素8mol／L，CHAPS 4％，DDT 50mmol／L，PMFS 0．14％。

分组提取液3：尿素5 mol／L，硫脲2 mol／L，SB3―10 2％，CHAPS 2％，DDT50mmol／L，PMFS 0．14％。

(2)特异蛋白预分级：利用所需分离蛋白质的特殊属性，使其预先富集并得到分析。常用的方法包括电泳、色谱、免疫沉淀等。

(3)亚细胞器分离：利用各种细胞器大小、形态和密度的不同，进行密度梯度离心或差速离心，分离出细胞内特定的细胞器，然后从细胞器中提取蛋白质，得到生物学上功能相关的一类蛋白质。该方法减少了蛋白质的分散性和复杂性。

(4)激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)：指利用特定的脉冲激光沿细胞边沿将所需细胞从组织中切割分拣出来的技术，已成功地用于肿瘤组织的分拣。该方法能够提高所获得蛋白质的特异性，减少异质性。但该技术制备用于蛋白组研究的蛋白质量时，工作量较大。