煮沸法快速提取质粒以及琼脂糖电泳与DNA酶解

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一． 实验目的 ：
1、 掌握质粒 DNA 分离，纯化的原理
2、 学习煮沸法快速提取质粒 DNA 的方法
3、 学习 DNA的限制性酶切的基本技术
4 、 学习利用琼脂 糖电泳测定 DNA片段的长度

二、 实验原理
在基因工程 中， DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度， DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。
琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

三 ． 实验材料和试剂：
1． 菌种： 含 pUC18 的大肠杆菌 JM107 菌株。
2． 化学试剂和溶液
（1） LB 培养基：
NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l
胰蛋白胨 10g/l 氨苄青霉素 50 μ g/ml （培养基灭菌后加入）
pH7.0
（2） 70% 乙醇（ -20 ℃）及无水乙醇（ -20 ℃）
（3） STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）
（4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨）
（5） 1.2M 氯化钠
（6） TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）
（7） 电泳缓冲液（ 50XTAE ）
Tris 242g， 冰醋酸 57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml
使用时用蒸馏水稀释 50 倍。
（8） 样品缓冲液（ 6X ）
0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖
（9） 溴化乙锭 10mg/ml
（10） 琼脂糖（电泳级）
（11） 限制性内切酶
（12） 溶菌酶（ 50mg/ml ，溶于 10mmol/L Tris-HCl ， pH 8.0 ）
3.仪器设备:
台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。
Eppendorf 离心管， Tip 头，三角瓶等灭菌备用。
电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（ 20ul, 200ul 和 1000ul ），离心管， Tips(200ul,1000ul) 。