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煮沸法快速提取质粒以及琼脂糖电泳与DNA酶解

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一、实验目的 :

1、 掌握质粒DNA 分离,纯化的原理

2、 学习煮沸法快速提取质粒DNA 的方法

3、 学习DNA的限制性酶切的基本技术

4 、 学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度

二、实验原理

在基因工程中,DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA 序列,在一定的条件下切断双链DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度,DNA 的纯度和甲基化程度等。对DNA 进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

琼脂糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色,可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要,还可以从凝胶中回收DNA 条带,用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的DNA 。长度 100kb 或更大的DNA ,可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液(一般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。

三 、实验材料和试剂:

1. 菌种:含 pUC18 的大肠杆菌 JM107 菌株。

2. 化学试剂和溶液

(1) LB 培养基:

NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l

胰蛋白胨 10g/l 氨苄青霉素 50 μ g/ml (培养基灭菌后加入) pH7.0

(2) 70% 乙醇 (-20 ℃)及无水乙醇( -20 ℃)

(3) STET 缓冲液( pH8.0 )( 8% 蔗糖, 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris )

(4) 5%CTAB (十六烷基三甲基溴化氨)

(5) 1.2M 氯化钠

(6) TE 缓冲液( 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA )

(7) 电泳缓冲液( 50XTAE )

Tris 242g, 冰醋酸 57.1ml,EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml 使用时用蒸馏水稀释 50 倍。

(8) 样品缓冲液( 6X ) 0.25% 溴酚蓝, 0.25% 二甲苯青, 40% ( W/V )蔗糖

(9) 溴化乙锭 10mg/ml

(10) 琼脂糖(电泳级)

(11) 限制性内切酶

(12) 溶菌酶( 50mg/ml ,溶于 10mmol/L Tris-HCl , pH 8.0 )

3.仪器设备:

台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。

Eppendorf 离心管, Tip 头,三角瓶等灭菌备用。

电泳仪,电泳槽,样品梳,微波炉,水浴锅,移液器( 20μl, 200μl 和 1000μl ),离心管,Tips(200μl,1000μl) 。


四 、操作步骤:

1.质粒提取

(1) 将2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为15ml 的试管中,接种一单菌落,用棉塞封口,在37 ℃剧烈震荡( 250rpm )培养过夜。

(2) 将1.5ml 培养物转入离心管中,用台式离心机在4 ℃条件下离心 30 秒(12,000 × g )。

(3) 弃上清液,用滤纸吸干离心管中的液体培养基,将细菌沉淀物悬浮于 200 mlSTET 缓冲液,用涡旋混合器充分混匀。

(4) 加入4 ml新鲜配制的溶菌酶液,混匀,置室温下5min 。

(5) 用漂子架住离心管,置于沸水浴中,精确记时45 秒,取出后立刻离心10min 。

(6) 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去,离心管的上清液中加入8 ml5%CTAB ,用混合器混匀后,高速离心5min ,弃上清液,用滤纸吸干离心管中的液体。

(7) 加入1.2M 氯化钠 300 ml,充分溶解沉淀物,再加入750 ml的冷乙醇,充分混匀后,离心15min ,弃上清液。

(8) 取1ml 70% 冷乙醇,缓慢淋洗离心管内壁,离心 5min 。弃上清液,用滤纸吸干管壁上的液体,置室温中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。

( 9 ) 沉淀物溶于 50 mlTE 缓冲液中,混合器混匀 。

(10) 即成质粒制备液,制备的质粒供下一步实验使用

加完反应液,混匀,离心 1分钟,置于37℃水浴中,反应2小时。加入加样缓冲液(10 ′) 2 ml

3. 质粒DNA的琼脂糖电泳

1) 量取100毫升TAE电泳液,加入0.7克琼脂糖,混匀后,置于微波炉中,加热

3分钟,充分溶解琼脂糖。 注意观察,当心煮沸的液体,溢出!

2) 用灭菌后的橡皮胶,封闭清洁干燥的电泳板,并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子,调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离,一般以 1-2毫米为宜。

3) 当溶解后的琼脂糖液冷却至 50℃左右时,加入溴化乙锭5 ml,溴化乙锭的最终浓度为1.0 m g/ml . 混匀后,将琼脂糖液倒入电泳板中,静止,切勿移动。

4) 在凝胶完全凝固后(于室温放置 30-45分钟),轻轻地取出梳子,除去胶带,将凝胶放入电泳漕中。

5) 电泳漕中,加入电泳液(1 ′ TAE),使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。

6) 取上一实验制备的质粒提取液(酶切),加入1/5样品缓冲液,充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中,分别加入DNA分子量标记物(marker ),对照以及质粒提取液(酶切)样品

7) 接通电源,在 90V下,电泳1小时,当溴酚兰颜料迁移至凝胶前沿时,切断电源。

8) 取出凝胶,在紫外灯下,观察 DNA的迁移位置,并讨论实验结果。

五、注意事项 :

(1) 从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时,一定要彻底,不能留有残余。

(2) 用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心,防止将核酸同洗液一起去掉。

(3) 在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌。

(4) 酶切时,应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一,否则限制酶活性将受到甘油的抑制。

(5)进行酶切消化时,将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶,并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头 。 操作要尽可能快,用完后立即将酶放回冰箱

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