煮沸法快速提取质粒以及琼脂糖电泳与DNA酶解

一、实验目的

1、掌握质粒DNA 分离，纯化的原理。

2、学习煮沸法快速提取质粒DNA 的方法。

3、学习DNA的限制性酶切的基本技术。

4 、学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度。

二、实验原理

在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA 序列，在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基化程度等。

对DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料- 溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。

用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp 至近50kbp 的DNA 。长度100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。

DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

三、实验材料和试剂

1. 菌种

含pUC18 的大肠杆菌JM107 菌株。

2. 化学试剂和溶液

　　（1） LB 培养基：
　　NaCl 10g/l 酵母提取物5g/l
　　胰蛋白胨10g/l 氨苄青霉素50 μ g/ml （培养基灭菌后加入）
　　pH7.0

　　（2） 70% 乙醇（-20 ℃）及无水乙醇（-20 ℃）

　　（3） STET 缓冲液（pH8.0 ）（8% 蔗糖，0.5%Triton，50mmol/L EDTA，10mmol/L Tris ）

　　（4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨）

　　（5） 1.2M 氯化钠

　　（6） TE 缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA ）

　　（7） 电泳缓冲液（50XTAE ）

　　Tris 242g， 冰醋酸57.1ml，EDTA（0.5mol/LpH8.0） 100ml
　　使用时用蒸馏水稀释50 倍。

　　（8） 样品缓冲液（6X ）

　　0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖

　　（9） 溴化乙锭10mg/ml

　　（10） 琼脂糖（电泳级）

　　（11） 限制性内切酶

　　（12） 溶菌酶（50mg/ml ，溶于10mmol/L Tris-HCl ，pH 8.0 ）

3.仪器设备

　　台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。

　　Eppendorf 离心管，Tip 头，三角瓶等灭菌备用。

　　电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（20ul，200ul 和1000ul ），离心管，Tips（200ul，1000ul）。