马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验

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一、实验目的
1. 学习从组织细胞中制备酶的方法。
2. 掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用的影响。
二、实验原理
多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6～7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。
多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚(儿茶酚)。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。
酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响，如温度、pH、底物种类、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。
三、实验器材
1.匀浆机
2.小刀，纱布，漏斗，其它玻璃器皿
3.离心机
4.冰箱
5.恒温水浴
四、材料与试剂
1.马铃薯
2.0.1mol/L的NaF溶液: 将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。
3.0.01mol/L的邻苯二酚溶液:将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中,用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0,防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。
4.pH6.8的磷酸盐缓冲液
5. 5%三氯乙酸溶液
6. 硫脲
7. 0.01mol/L的间苯二酚溶液:将0.11g间苯二酚溶解于100mL水中。
8.0.01mol/L的对苯二酚溶液:将0.11g对苯二酚溶解于100mL水中。
9.固体硫酸铵
10.0.8%HCl：19.2mL浓HCl加水稀释到1000mL。
11.0.2%和0.3%(V/V)的乳酸溶液。
12. 0.5%的碳酸钠溶液
13.0.01%的碳酸钠溶液
五、操作方法
1.多酚氧化酶的制备
每三个小组一起，称取150g马铃薯(新马铃薯可以不去皮)，切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。
各组分别量取50mL滤液置离心管中，于3500转/min离心5～10min，取上清夜，加入固体硫酸铵16g，溶解，于4℃放置30min，于3500转/min离心15min，倒掉上清液，沉淀用15mL pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗酶液，含有马铃薯多酚氧化酶。
2.多酚氧化酶的催化作用
按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
表1 多酚氧化酶的催化作用

试管号	酶液	邻苯二酚	水	混匀后37℃保温5～10min，观察颜色变化
1	15滴	15滴	－
2	15滴	－	15滴
3	－	15滴	15滴

3. 多酚氧化酶的化学性质
按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
表2 多酚氧化酶的化学性质

试管号	酶液	5％三氯乙酸	硫脲	振荡混匀后分别加入邻苯二酚15滴，于37℃保温10min，观察颜色变化
1	15滴	－	－
2	15滴	15滴	－
3	15滴	－	少许

4.底物专一性
按表3加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
表3 多酚氧化酶的底物专一性

试管号	酶液	邻苯二酚	间苯二酚	对苯二酚	混匀后37℃保温5～10min，观察颜色变化
1	15滴	15滴	－	－
2	15滴	－	15滴	－
3	15滴	－	－	15滴

5.底物浓度的影响
按表4加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
表4 底物浓度的影响

试管号	酶液	邻苯二酚	水	混匀后37℃保温1min，观察颜色变化
1	5滴	1滴	39滴
2	5滴	10滴	30滴
3	5滴	40滴	－

6.酶浓度的影响
按表5加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
表5 酶浓度的影响

试管号	酶液	邻苯二酚	水	混匀后37℃保温2min，观察颜色变化
1	15滴	15滴	－
2	1滴	15滴	14滴

1. 氢离子浓度的影响
按表6加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

管号	1	2	3	4	5
0.8% HCl	40滴	-	-	-	-
0.3% 乳酸	-	40滴	-	-	-
0.2% 乳酸	-	-	40滴	-	-
0.01%碳酸钠	-	-	-	40滴	-
0.5%碳酸钠	-	-	-	-	40滴
邻苯二酚	7滴	7滴	7滴	7滴	7滴
酶液	7滴	7滴	7滴	7滴	7滴
混合后pH值	1	3	5	7	9
37℃保温5min，观察颜色变化,确定最适pH值

六、思考题
1.在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么?
2.在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用?
3.该多酚氧化酶的最适pH值是多少?为什么?
4.通过实验可知哪些因素会影响酶的催化活力?