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马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验

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一、实验目的

1. 学习从组织细胞中制备酶的方法。

2. 掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用的影响。

二、实验原理

多酚氧化酶是一种含铜的酶,其最适pH值为6~7。由多酚氧化酶催化的反应,如以邻苯二酚为底物,可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定,这个反应在自然界中是常见的,如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。

多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚(儿茶酚)。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似,它们也可以被氧化为各种有色物质。

酶是生物催化剂,其催化活性易受各种因素的影响,如温度、pH、底物种 类、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。

三、实验器材

1.匀浆机

2.小刀,纱布,漏斗,其它玻璃器皿

3.离心机

4.冰箱

5.恒温水浴

四、材料与试剂

1.马铃薯

2.0.1mol/L的NaF溶液: 将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。

3.0.01mol/L的邻苯二酚溶液:将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中,用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0,防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时,应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。

4.pH6.8的磷酸盐缓冲液

5. 5%三氯乙酸溶液

6. 硫脲

7. 0.01mol/L的间苯二酚溶液:将0.11g间苯二酚溶解于100mL水中。

8.0.01mol/L的对苯二酚溶液:将0.11g对苯二酚溶解于100mL水中。

9.固体硫酸铵

10.0.8%HCl:19.2mL浓HCl加水稀释到1000mL。

11.0.2%和0.3%(V/V)的乳酸溶液。

12. 0.5%的碳酸钠溶液

13.0.01%的碳酸钠溶液

五、操作方法

1.多酚氧化酶的制备

每三个小组一起,称取150g马铃薯(新马铃薯可以不去皮),切块后放入匀浆机,加入150mLNaF溶液,匀浆后用四层纱布过滤。

各组分别量取50mL滤液置离心管中,于3500转/min离心5~10min,取上清夜,加入固体硫酸铵16g,溶解,于4℃放置30min,于3500转/min离心15min,倒掉上清液,沉淀用15mL pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解,即为粗酶液,含有马铃薯多酚氧化酶。

2.多酚氧化酶的催化作用

按表1加入各试剂,观察反应现象并记录和分析原因。

表1 多酚氧化酶的催化作用

试管号 酶液 邻苯二酚 混匀后37℃保温5~10min,观察颜色变化
1 15滴 15滴
2 15滴 15滴
3 15滴 15滴

3. 多酚氧化酶的化学性质

按表2加入各试剂,观察反应现象并记录和分析原因。

表2 多酚氧化酶的化学性质
试管号 酶液 5%三氯乙酸 硫脲 振荡混匀后分别加入邻苯二酚15滴,于37℃保温10min,观察颜色变化
1 15滴
2 15滴 15滴
3 15滴 少许

4.底物专一性

按表3加入各试剂,观察反应现象并记录和分析原因。

表3 多酚氧化酶的底物专一性
试管号 酶液 邻苯二酚 间苯二酚 对苯二酚 混匀后37℃保温5~10min,观察颜色变化
1 15滴 15滴
2 15滴 15滴
3 15滴 15滴

5.底物浓度的影响

按表4加入各试剂,观察反应现象并记录和分析原因。

表4 底物浓度的影响
试管号 酶液 邻苯二酚 混匀后37℃保温1min,观察颜色变化
1 5滴 1滴 39滴
2 5滴 10滴 30滴
3 5滴 40滴

6.酶浓度的影响

按表5加入各试剂,观察反应现象并记录和分析原因。

表5 酶浓度的影响
试管号 酶液 邻苯二酚 混匀后37℃保温2min,观察颜色变化
1 15滴 15滴
2 1滴 15滴 14滴

1. 氢离子浓度的影响

按表6加入各试剂,观察反应现象并记录和分析原因。
管号 1 2 3 4 5
0.8% HCl 40滴 - - - -
0.3% 乳酸 - 40滴 - - -
0.2% 乳酸 - - 40滴 - -
0.01%碳酸钠 - - - 40滴 -
0.5%碳酸钠 - - - - 40滴
邻苯二酚 7滴 7滴 7滴 7滴 7滴
酶液 7滴 7滴 7滴 7滴 7滴
混合后pH值 1 3 5 7 9
37℃保温5min,观察颜色变化,确定最适pH值

六、思考题

1.在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么?

2.在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用?

3.该多酚氧化酶的最适pH值是多少?为什么?

4.通过实验可知哪些因素会影响酶的催化活力?

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