羧肽酶的制备及其性质

【目的要求】
1.实验目的
⑴ 通过学习生化及相关学科的理论和技术，熟悉并进一步掌握酶的提取、分离、纯化、检测及其生物学性质和理化性质的实验技能。
⑵ 初步培养从总体水平进行实验的设计，进一步加强并提高综合分析解决问题的能力。
⑶ 培养科研工作中的协作精神和勤俭而高效的科研作风。
2.实验要求
⑴ 本实验由面包酵母为初始材料，制备高纯度羧肽酶Y，对羧肽酶Y生化性质的检测。
⑵ 通过相关文献资料的收集、分析、设计本实验的可行报告。
⑶ 可行性报告包括实验目的、意义、国内外进展、实验方法和技术路线及可行性分析、实验预期结果。
⑷ 在本实验开始前一个月，将实验报告草案提交指导教师，以审核和准备实验材料等。
⑸ 实验报告草案应提供最少十篇文献，其中至少有两篇是近五年内的文献，包括新技术、新方法在生物大分子研究中的应用。
(6) 文献按学术期刊论文的格式要求，即作者、文章名、刊名、年、卷(期)、页码，参考书籍类同。
⑺ 本实验基本两人一组，在部分实验中需几组合作进行。
⑻ 实验报告包括：采用实验的原理；实验所需试剂、 仪器 、设备；提取、分离、纯化的每步骤的蛋白回收率、活性回收率，最终产率；按实验内容，提供实验结果及相关图表；完成实验后从整体上进行相关的讨论。
【实验内容】
1．羧肽酶Y活性检测
⑴ 酶活力测定方法
⑵ 酶活力单位定义
⑶ 比活力定义
⑷ 蛋白含量测定方法
2. 面包酵母羧肽酶Y的提取
⑴ 每组500克新鲜面包酵母
⑵ 利用溶解度等原理进行羧肽酶Y提取
⑶ 羧肽酶Y的活化
3. 羧肽酶Y的分离、纯化
⑴ 利用各种方法，从上述提取液分离羧肽酶Y
⑵ 每步纯化前蛋白纯度检测
⑶ 分离纯化过程中跟踪检测活性组份蛋白质含量和酶活性
4. 羧肽酶Y理化性质
⑴ 采用两种方法验证羧肽酶Y纯度
⑵ 羧肽酶Y的分子量测定
⑶ 羧肽酶Y的等电点测定
5. 羧肽酶Y的酶学性质
⑴ 在活力单位定义确定后，求出羧肽酶Y的Vmax和Km
⑵ 初步确定羧肽酶Y的最适pH
⑶ 初步确定羧肽酶Y的最适温度
⑷ 提出最少两种羧肽酶Y的可逆抑制剂并验证抑制类型
⑸ 提出羧肽酶Y的激活性并验证
(6) 羧肽酶Y的热稳定性
【实验原理】
羧肽酶Y(Carboxypeptidase Y)是由面包酵母中分离得到的一种蛋白水解酶，它对肽和蛋白质羧基末端的各种氨基酸(包括脯氨酸)具有广泛的水解能力，因此该酶已成为C末端分析中常用的一种工具酶。羧肽酶Y与胰羧肽酶A和B不同，它是一种不含金属离子的酸性糖蛋白。