影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
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（李欣 郭树华 军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）
摘要 要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量，必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体 整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。本文就这些因素进行分析，并提出一定的对策和建议。
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原 ，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。
1、外源基因特性
外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录 引;不合适的mRNA5"非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5"非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5"非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。但遗憾的是，限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产甚至仅仅能否表达。至仅仅能否表达。
2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOXl和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase , HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主菌的甲醇利用表型(Mut＋和MutＳ)
用末端与aox1基因5"和3"端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。当诱导AOX1时，转化子不能同时高水平产生酒精氧化酶和外源蛋白，与野生型Mut＋比较，Mut－细胞对氧的要求亦较低，生长也较慢。为解决这个问题，Jeffrey等用甲醇加甘油混合饲养，得到了255mg/L的CD40配体(CD40L)。但由于甘油可部分阻遏aoxl启动子，蛋白表达可能并不处于最佳水平。Sreekrishna等最近运用山梨醇和甲醇混合批量饲养发酵，在不到4个星期的时间里，他们用一个4L的发酵罐连续完成了几个周期的生产。在这种发酵方式中，大部分碳源由山梨醇提供，减少了总的甲醇消耗，因而效率大大提高。
最近，一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源蛋白的毕赤酵母载体pCAPZ和pGAPZa已经构建成功，组成性表达的蛋白量与该蛋白对酵母菌的毒性有关。研究发现它们常能生产比诱导型载体pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。这些载体均利用了编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子。Doring等分别用pGAPZB和pPICZB来生产兔肾肽转运蛋白（rPEPT2）以及人小肠肽转运蛋白(hPEPT2),结果发现，前者表达的此两种蛋白的产量均比后者高4倍。看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时，pGAP比pAOX1更理想。
