影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
丁香园论坛
2043
摘要 要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量，必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。本文就这些因素进行分析，并提出一定的对策和建议。
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。
1、外源基因特性
外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。但遗憾的是，限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产甚至仅仅能否表达。至仅仅能否表达。
2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOXl和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase , HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主菌的甲醇利用表型(Mut＋和MutＳ)
用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。当诱导AOX1时，转化子不能同时高水平产生酒精氧化酶和外源蛋白，与野生型Mut＋比较，Mut－细胞对氧的要求亦较低，生长也较慢。为解决这个问题，Jeffrey等用甲醇加甘油混合饲养，得到了255mg/L的CD40配体(CD40L)。但由于甘油可部分阻遏aoxl启动子，蛋白表达可能并不处于最佳水平。Sreekrishna等最近运用山梨醇和甲醇混合批量饲养发酵，在不到4个星期的时间里，他们用一个4L的发酵罐连续完成了几个周期的生产。在这种发酵方式中，大部分碳源由山梨醇提供，减少了总的甲醇消耗，因而效率大大提高。
最近，一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源蛋白的毕赤酵母载体pCAPZ和pGAPZa已经构建成功，组成性表达的蛋白量与该蛋白对酵母菌的毒性有关。研究发现它们常能生产比诱导型载体pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。这些载体均利用了编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子。Doring等分别用pGAPZB和pPICZB来生产兔肾肽转运蛋白（rPEPT2）以及人小肠肽转运蛋白(hPEPT2),结果发现，前者表达的此两种蛋白的产量均比后者高4倍。看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时，pGAP比pAOX1更理想。
4、基因剂量
许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。
因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准。Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上清液中获得了255mg的重组cD40L。
5、分泌信号
对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对因子(AMF)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性大。
但酵母表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸。这可能是酵母细胞自身调节机制对外源基因高表达的应答表现。Singh等通过定向缺失诱变MFa1和干扰素基因连接处寡核甘酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放，可以成为解决这一问题的一种好方法。
6、产物稳定性
酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶，能专一性水解a因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸(如LySArg，LysLys，ArgArg，LsArg)，酵母基因工程表达产物发生降解现象的原因就在于此。改变培养基的PH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如EDTA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。
另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。
在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况。如重组人基质金属蛋白酶3(MMP-3)被认为有促使哺乳动物上皮细胞凋亡的作用。它在Pp中高度降解，仅当与其组织抑制物TIMP-1共表达时才能保持稳定。这也提醒我们外源基因本身对产物稳定性的影响同样重要。
7、翻译后修饰
一般情况下Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度在8－14个之间，使产物更加稳定，而这正是Pp表达外源蛋白的一个优势。虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人红细胞生成素受体的胞外配体结合区(EPObp)因糖基化程度不同而呈两种状态(30X103和60X103);人组织因子则在SDS-PAGE上以从37X103到45X103的3个条带存在。另外，聚合体的存在也会成为产物不均一的原因，这些都给基因工程产物的纯化和工业化生产带来一定困难。从药物应用的观点来看，不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用，并且会明显影响纯化过程中产率的提高，因此，选用一种能够获得单体均一形式的基因工程产物十分重要。这方面的研究仍有待探索。
作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主体，Pp酵母菌兼有原核细胞的分子遗传操作和生长特性及真核生物的翻译后修饰机制的长处。虽然目前存在的诸多困难使得仍有许多蛋白难以在这个系统中成功表达，但随着对它的利用和探索的不断深入必将不断给我们增添新的见解，使我们有理由相信会最终解决这些困难，将巴氏毕赤酵母系统不断完善。
（李欣 郭树华 军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。
1、外源基因特性
外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。但遗憾的是，限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产甚至仅仅能否表达。至仅仅能否表达。
2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOXl和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase , HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主菌的甲醇利用表型(Mut＋和MutＳ)
用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。当诱导AOX1时，转化子不能同时高水平产生酒精氧化酶和外源蛋白，与野生型Mut＋比较，Mut－细胞对氧的要求亦较低，生长也较慢。为解决这个问题，Jeffrey等用甲醇加甘油混合饲养，得到了255mg/L的CD40配体(CD40L)。但由于甘油可部分阻遏aoxl启动子，蛋白表达可能并不处于最佳水平。Sreekrishna等最近运用山梨醇和甲醇混合批量饲养发酵，在不到4个星期的时间里，他们用一个4L的发酵罐连续完成了几个周期的生产。在这种发酵方式中，大部分碳源由山梨醇提供，减少了总的甲醇消耗，因而效率大大提高。
最近，一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源蛋白的毕赤酵母载体pCAPZ和pGAPZa已经构建成功，组成性表达的蛋白量与该蛋白对酵母菌的毒性有关。研究发现它们常能生产比诱导型载体pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。这些载体均利用了编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子。Doring等分别用pGAPZB和pPICZB来生产兔肾肽转运蛋白（rPEPT2）以及人小肠肽转运蛋白(hPEPT2),结果发现，前者表达的此两种蛋白的产量均比后者高4倍。看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时，pGAP比pAOX1更理想。
4、基因剂量
许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。
因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准。Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上清液中获得了255mg的重组cD40L。
5、分泌信号
对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对因子(AMF)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性大。
但酵母表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸。这可能是酵母细胞自身调节机制对外源基因高表达的应答表现。Singh等通过定向缺失诱变MFa1和干扰素基因连接处寡核甘酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放，可以成为解决这一问题的一种好方法。
6、产物稳定性
酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶，能专一性水解a因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸(如LySArg，LysLys，ArgArg，LsArg)，酵母基因工程表达产物发生降解现象的原因就在于此。改变培养基的PH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如EDTA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。
另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。
在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况。如重组人基质金属蛋白酶3(MMP-3)被认为有促使哺乳动物上皮细胞凋亡的作用。它在Pp中高度降解，仅当与其组织抑制物TIMP-1共表达时才能保持稳定。这也提醒我们外源基因本身对产物稳定性的影响同样重要。
7、翻译后修饰
一般情况下Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度在8－14个之间，使产物更加稳定，而这正是Pp表达外源蛋白的一个优势。虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人红细胞生成素受体的胞外配体结合区(EPObp)因糖基化程度不同而呈两种状态(30X103和60X103);人组织因子则在SDS-PAGE上以从37X103到45X103的3个条带存在。另外，聚合体的存在也会成为产物不均一的原因，这些都给基因工程产物的纯化和工业化生产带来一定困难。从药物应用的观点来看，不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用，并且会明显影响纯化过程中产率的提高，因此，选用一种能够获得单体均一形式的基因工程产物十分重要。这方面的研究仍有待探索。
作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主体，Pp酵母菌兼有原核细胞的分子遗传操作和生长特性及真核生物的翻译后修饰机制的长处。虽然目前存在的诸多困难使得仍有许多蛋白难以在这个系统中成功表达，但随着对它的利用和探索的不断深入必将不断给我们增添新的见解，使我们有理由相信会最终解决这些困难，将巴氏毕赤酵母系统不断完善。
（李欣 郭树华 军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）
