毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用

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张伍魁范清林宋礼华
（安徽医科大学 基础医学院合肥230032）

摘要巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达 中的研究进展及应用。
关键词巴斯得毕赤酵母外源基因糖基化
中图分类号Q786

巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统［1］，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷［2］。除此之外，由于它在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点而使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一：(1)它所具有的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；(2)由于它可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；(3)表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L［3］，而明胶的表达量甚至达到了14.8g/L［4］，已有报道其胞内表达量惊人，甚至达到了22g/L；(4)外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽α因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程，如表达的重组水蛭素（HIR），仅经过二步层析纯化就可达到97％以上的纯度；(5)整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定。有文献报道通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代却未见外源基因丢失的现象［5］；(6)糖基化程度低，毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8~14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50~150甘露糖残基要短得多［6］，同时，由于毕赤酵母不能象酿酒酵母那样在核心多糖末端形成α1,3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原 性远远低于后者。因而更适合于治疗用途［7］；(7)该表达系统由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。
1常用表达菌株及表达载体1.1表达菌株
P.pastoris作为一种甲醇利用型酵母菌，自1969年开发以来，通过数十年的研究，至今已有多个种属被开发出来，新近发展起来的嗜甲醇酵母包括Candida和Pichia 2个种属，共有30余种［8］，其中尤以P.pastoris发展最快，研究最清楚。目前，用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建，主要有：Y11430，MG1003，GS115，KM71和SMD1168，其中Y11430为野生型，其余皆为组氨酸突变型，GS115有完整的aox1基因，在甲醇培养基上表型为Mut+，当用重组表达载体转化后，由于表达载体线化所用酶不同，其转化子表型可能是Mut+或Muts，可通过MD和MM培养基进行表型的鉴定；KM71的aox1基因被ARG4基因替代，虽然aox2和aox1有97％同源性，但aox2利用甲醇的能力远比aox1弱［9］，在甲醇培养基上表现为Muts，其转化子也是Muts，表型不必鉴定。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株，特别适用于分泌表达载体，可避免表达外源蛋白被宿主菌同时表达的蛋白酶所降解，其它蛋白酶缺陷型主要还有SMD1165和SMD1163［10］。MC1003的aox基因全部删除，不能利用甲醇，即表型为Mut－His－。
1.2表达载体
P.pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体，目前常用的表达载体多是美国Invitrogen公司开发构建的。P.pastoris既有分泌表达型的，又有胞内表达型的。常用的表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHILS，pAO815，pHILD2和pPICz等，其中pPIC9，pPIC9K和pHILS为分泌型表达载体，而pAO815，pHILD2和pPICz为胞内型表达载体，不同载体除具有各自特殊的基因组件外，还具有一些共同的序列，如这些载体都包括一个表达盒（cassette）和一个多克隆位点。表达盒由900bp的5′aox1序列和约300bp的3′转录终止序列组成［9］，用特异的酶切割多克隆位点可以使目的基因插入到相应的酶切位点中。多数P.pastoris表达载体还含有HIS4基因，它可以作为转化体的选择标记，同时还含有在细菌中复制所必须的序列及一些选择标记，如大肠埃希氏菌的复制起始点和Amp抗性基因等；还有一些载体含有来自于aox1基因的3′端侧翼序列，它可以用来指导含外源基因的组件插入3′aox1基因位点或以基因整合的方式整合到酵母染色体的aox1位点［11］。
一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。多拷贝发生在aox1或组氨酸基因位点，但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%~10％，为此，人们根据不同表达载体的组成特点，如pPIC3K，pPIC9K含有kanr抗性基因；pPICz系列含有bler基因，利用基因剂量效应，分别依靠G418R或ZeocinR的抗性水平来快速筛选除高拷贝的整合转化子。对于PAO815，一般通过多拷贝表达盒BamHIBglII串联而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体，然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子［12］。
2006, 26(1)张伍魁 等： 毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.1 2006
2基因整合及表达调控的机理2．1基因整合
像酿酒酵母一样，表达载体通过酶切线性化之后，可与P.pastoris基因组的同源序列发生同源重组而产生稳定的重组转化子［13］。目前，把载体线性化的DNA转入到宿主菌主要有4种方法，即电穿孔法、原生质体法、PEG法和锂盐法。其中原生质体法和电穿孔法转化效率最高，且有时可得到含多拷贝外源基因的转化子，有报道称电穿孔法的转化效率可高达105/μg。同时由于电穿孔法简便、快捷、高效，故是目前最理想的转化P.pastoris的方法。P.pastoris重组可分两种情况：一种是单交换，即在HIS或5′aox的单酶切位点将质粒载体线性化，通过单交换（插入）整合入染色体，这样由于aox1基因仍然保留，所得到的转化子表型为Mut+；另一种为双交换（或替换），即外源基因通过重组替换了染色体上的aox1基因，从而造成aox1的缺失，得到的转化子为Muts。