腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法
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实验九 腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法
在机体的免疫过程中,巨噬细胞(MF)承担着噬菌、杀菌、清除机体内被损伤和衰老的细胞,以及传递抗原 信息;MF将捕获的抗原进行加工处理后,把降解的抗原信息传递给T、B淋巴细胞。MF又是天然杀伤细胞(NK细胞)的激活剂,且对B淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。
实 验 目 的
掌握巨噬细胞(MF)体外吞噬异物能力的测定方法,观察机体的非特异性免疫 现象。
实 验 原 理
巨噬细胞(MF)在机体的非特异性免疫中具有重要作用,其吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的高低。本实验采用测定小鼠腹腔MF吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数,来评价免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)对机体免疫状态的抑制作用。
实 验 用 品
一、材料
1. 小白鼠6~10只,随机分为二组。
2. 5%鸡红细胞悬液:用已灭菌的注射器,自健康鸡的翼下静脉采血1ml,放置于5倍体积的Alsever"s溶液中。4℃条件下可保存一周。使用时用灭菌的生理盐水洗涤3遍(2000r/min,每次5min),然后用生理盐水配成5%的浓度。
二、试剂
1. Alsever"s溶液
葡萄糖 2.05g
柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)0.89g
氯化钠 0.42g
溶解后加蒸馏水至100ml,用柠檬酸(C6H8O7·H2O)调pH至7.2,超滤除菌或6.6′104Pa(10磅)灭菌20min,保存4℃冰箱备用。
2. Hank’s液
(1)贮存液(药品全部用AR试剂),
甲液: ①NaCl 80g, MgSO4·7H2O 1g, MgCl2·6H2O 1g,用双蒸馏水定容至450ml。
②CaCl2 1.4g双蒸馏水定容至50ml。
将①、②液混合,加氯仿1ml。
乙液: Na2HPO4·l2H2O 1.52g,KH2PO4 0.6g, 酚红0.2g, 葡萄糖l0g, 用双蒸馏水定容至500ml, 加氯仿lml。
(2)应用液:
贮存液甲:贮存液乙:双蒸馏水=1:1:18。6.6′104Pa (10磅)灭菌20min。4℃保存可使用1个月。临用前,用3.5%的NaHCO3调pH至7.2。
3. 0.9%生理盐水(灭菌)
4. Giemsa染液
(1)贮存液:
称取Giemsa粉0.5g研细,再将33ml甘油逐滴加入,继续研磨至无颗粒。80℃水浴过夜,然后加入33ml甲醇。置棕色瓶中,于56℃放置24h后即可使用。
(2)应用液:
临用时取贮存液lml加l0ml pH7.4磷酸缓冲液 ,混匀后过滤。
5. 甲醇
6. 肝素钠溶液: 用灭菌生理盐水配制。每20IU 0.1ml可抗凝1ml全血。
7. 0.6%环磷酰胺溶液: 用灭菌生理盐水配制。
三、设备
保温箱、显微镜、带盖解剖盘.医用剪刀、镊子、刻度离心管及试管架、载玻片、滴管、酒精及碘酒棉球、擦镜纸、称量纸及滤纸。
实 验 方 法
实验前二天,给实验组小鼠腹腔注射0.6%的环磷酰胺(0.2ml/只)
对照组小鼠注射灭菌生理盐水
↓
每只小鼠注射pH7.2 的Hank液 2m1
(腹腔注射时进针切忌过深,针头方向最好向后,以免伤其内脏,使血管破损出血,影响实验取材)
↓
实验当天给小鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.5ml/只
↓2~3h后
脱颈法处死小鼠立即由腹腔注入lml生理盐水
↓轻揉小鼠腹部约lmin,剪开腹部皮肤,肌肉层上开口
滴管伸入腹腔吸出腹腔液,置于滴有肝素钠的离心管中混匀
↓
把腹腔液滴加在洁净的载玻片上
↓
将载玻片置于带盖解剖盘中(盘底部放2~3盒湿沙布)
↓37℃培养箱孵育30min
取出玻片,漂洗去上清液和末粘附在玻片上的细胞
(漂洗标准: 在显微镜下检查无重叠细胞层,且水流不要过急以免将贴附在玻片上的MF冲掉)
↓室温下晾干或用吹风机吹干载玻片
Giemsa染液染色5~l0min
↓
冲洗去多余染液,晾干
↓
高倍镜或油镜下观察并计数计算出吞噬百分率和吞噬指数