小鼠腹腔巨噬细胞贴壁法分离及纯化

巨噬细胞（macrophages，MΦ）是由血液中单核细胞迁入组织后分化形成的成熟类细胞，广泛分布于脾脏、肝脏、腹腔、骨髓、神经系统以及结缔组织等，具有吞噬杀伤、抗原提呈及免疫调节作用。根据不同的表型和功能特点通常将其分为两种类型：经典活化的巨噬细胞（classically activated macrophage，CAM），又称 M1 型巨噬细胞；替代性活化的巨噬细胞（alternatively activated macrophage，AAM），又称 M2 型巨噬细胞。

巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可存活 2～3 周，难以长期生存，多做原代培养。可用多种方法培养不同来源的 MΦ，其中以腹腔取材法最为常用，从小鼠腹腔渗出细胞中分离及纯化 MΦ，正常小鼠每只可收集腹腔渗出细胞约 10⁶，其中 MΦ 占 30％。

贴壁法的基本原理是根据单核巨噬细胞具有黏附塑料或玻璃表面的特性所建立的细胞贴壁法，可将单核巨噬细胞和淋巴细胞分开。

常用于对细胞纯度要求不高的实验。

动物：6~8 周龄 C57/BL6J 小鼠

试剂：RPMI 1640 培养基（含 10％ 胎牛血清，双抗），PBS 液，75% 酒精

仪器：解剖固定板、试管（或离心管）、注射器、剪刀、镊子、细胞培养孔板（或培养皿）、细胞计数板、移液器及吸头、超净台、二氧化碳孵箱、离心机

1）小鼠颈椎离断处死，75％ 乙醇消毒，移入超净台内仰卧固定于解剖固定板上。

2）剪开腹部毛皮层，暴露大面积腹膜，避开血管，注射器抽取 5 ml 含双抗的 RPMI 1640 培养基，腹腔注入，轻揉腹部 1~2 分钟，静置 5 分钟。

3）用镊子提起腹膜剪一小口（吸头可进入即可），用移液器吸取腹腔内液体（注意避开肠管），置于离心管中。

4）离心洗涤 1 500 r/min，5 分钟，再用含双抗的 RPMI 1640 培养基洗涤一次后离心，加入新鲜培养液重新悬浮细胞，计数。

5）调整细胞至所需浓度，置于平皿或细胞培养孔板中，37 ℃ CO₂ 孵箱中孵育 1～2 小时。

6）去除培养液，以 37 ℃ 预温培养液洗涤 2 遍，弃去未黏附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞，再加入适当培养液培养。

（1）从下腹部一侧进针注入灌洗液，以确保针眼收缩，不至于因腹腔液的增加而从针眼处出血，避免血细胞混入巨噬细胞悬液中。

（2）腹腔注射后应轻揉腹部，既要避免渗血，又要确保巨噬细胞游离出来，然后彻底灌洗，尽可能获得较多的巨噬细胞。如果吸出的灌洗液液呈淡黄色，则获得的巨噬细胞较多；如果吸出的灌洗液仍为无色透明，获得巨噬细胞则较少。分析此现象可能是游离出的大量巨噬细胞使其环境变为酸性所致。

（3）无菌条件下打开腹腔，直视吸取，可防止因吸入肠系膜或腹膜等而堵塞针眼的现象，并可迅速且较完全地吸出灌洗液。

（4）收集炎性腹腔巨噬细胞时，处死小鼠前先用注射器向小鼠腹腔注射 1 ml 3% 豚蛋白胨肉汤或 2 ml 无菌的液体石蜡，待 3~4 天后按上述步骤收集。