巨噬细胞的分离和纯化

巨噬细胞的分离

 

1 ）从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞

 

1． 取 6 周左右的小鼠（或 600 克左右的豚鼠，或 3 公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射 1ml （豚鼠 20ml ，家兔 200ml ）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或 4 ％淀粉肉汤。 3 ～ 4 天以后收集腹腔细胞。

2． 如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入 3 ～ 4ml （豚鼠 20 ～ 40ml ，家兔 50 ～ 70ml ）冰中预冷的无菌 PBS-H （含 10U/ml 肝素和 10 ％小牛血清的 PBS ）。轻轻按摩腹部 5 分钟。

3． 以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷 PBS-H 冲洗腹腔 2 ～ 3 次。合并渗出液于离心管中， 4 ℃离心 250 × g 10 分钟，去上清液。

4． 用预冷的 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 3 次，每次 4 ℃离心 250 × g 10 分钟，去上清液。用预冷的适量 RPMI-1640 培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

 

 

2 ）家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化

 

1． 取 2 ～ 3 公斤重的家兔，耳缘静脉注射 10ml 空气处死动物或注射 2ml （含 130mg ）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2． 分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射 40ml 无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用 40ml 无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置 4 ℃。

3． 分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷 RPMI-1640 培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷 RPMI-1640 培养液的 20ml 注射器接 23 号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过 200 目的钢丝网，分离单个细胞。

4． 以下过程均在 4 ℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心 200 × g 10 分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入 10ml 低渗液（ 20mmol/L Tris, 0.75% 氯化铵， pH7.4 ）， 37 ℃处理 3 ～ 5 分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的 1 ％和 10 ％。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

5． 离心 200 × g 10 分钟，去上清液。用 RPMI-1640 培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重 1.077 ）上，离心 400 × g 20 分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

6． 用 RPMI-1640 培养液洗涤巨噬细胞 2 次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达 90 ％以上，巨噬细胞占全部细胞的 90 ％以上。

 

 

3 ）从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞

 

1． 用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷 RPMI-1640 培养液（含 1 ％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过 200 目的钢丝网，获得单个细胞。

2． 离心 200 × g 10 分钟，去上清液。用含 1 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞配成约 1 × 10⁸ ～ 5 × 10⁸ /ml 。