腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法

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在机体的免疫过程中，巨噬细胞(MF)承担着噬菌、杀菌、清除机体内被损伤和衰老的细胞，以及传递抗原 信息;MF将捕获的抗原进行加工处理后，把降解的抗原信息传递给T、B淋巴细胞。MF又是天然杀伤细胞(NK细胞)的激活剂，且对B淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。

实 验 目 的

掌握巨噬细胞(MF)体外吞噬异物能力的测定方法，观察机体的非特异性免疫 现象。

实 验 原 理

巨噬细胞(MF)在机体的非特异性免疫中具有重要作用，其吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的高低。本实验采用测定小鼠腹腔MF吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，来评价免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)对机体免疫状态的抑制作用。

实 验 用 品

一、材料

1. 小白鼠6~10只，随机分为二组。

2. 5%鸡红细胞悬液：用已灭菌的注射器，自健康鸡的翼下静脉采血1ml，放置于5倍体积的Alsever"s溶液中。4℃条件下可保存一周。使用时用灭菌的生理盐水洗涤3遍(2000r/min，每次5min)，然后用生理盐水配成5%的浓度。

二、试剂

1. Alsever"s溶液

葡萄糖 2.05g

柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O) 0.89g

氯化钠 0.42g

溶解后加蒸馏水至100ml，用柠檬酸(C6H8O7·H2O)调pH至7.2，超滤除菌或6.6′104Pa(10磅)灭菌20min，保存4℃冰箱备用。

2. Hank’s液

(1)贮存液(药品全部用AR试剂)，

甲液: ①NaCl 80g, MgSO4·7H2O 1g, MgCl2·6H2O 1g，用双蒸馏水定容至450ml。

②CaCl2 1.4g双蒸馏水定容至50ml。

将①、②液混合，加氯仿1ml。

乙液: Na2HPO4·l2H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g, 酚红0.2g, 葡萄糖l0g, 用双蒸馏水定容至500ml, 加氯仿lml。

(2)应用液:

贮存液甲:贮存液乙:双蒸馏水=1:1:18。6.6′104Pa (10磅)灭菌20min。4℃保存可使用1个月。临用前，用3.5%的NaHCO3调pH至7.2。

3. 0.9%生理盐水(灭菌)

4. Giemsa染液

(1)贮存液:

称取Giemsa粉0.5g研细，再将33ml甘油逐滴加入，继续研磨至无颗粒。80℃水浴过夜，然后加入33ml甲醇。置棕色瓶中，于56℃放置24h后即可使用。

(2)应用液:

临用时取贮存液lml加l0ml pH7.4磷酸缓冲液 ，混匀后过滤。

5. 甲醇

6. 肝素钠溶液: 用灭菌生理盐水配制。每20IU 0.1ml可抗凝1ml全血。

7. 0.6%环磷酰胺溶液: 用灭菌生理盐水配制。

三、设备

保温箱、显微镜、带盖解剖盘.医用剪刀、镊子、刻度离心管及试管架、载玻片、滴管、酒精及碘酒棉球、擦镜纸、称量纸及滤纸。

实 验 方 法

实验前二天，给实验组小鼠腹腔注射0.6%的环磷酰胺(0.2ml/只)

对照组小鼠注射灭菌生理盐水

↓

每只小鼠注射pH7.2 的Hank液 2m1

(腹腔注射时进针切忌过深，针头方向最好向后，以免伤其内脏，使血管破损出血，影响实验取材)

↓

实验当天给小鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.5ml/只

↓2~3h后

脱颈法处死小鼠立即由腹腔注入lml生理盐水

↓轻揉小鼠腹部约lmin，剪开腹部皮肤,肌肉层上开口

滴管伸入腹腔吸出腹腔液，置于滴有肝素钠的离心管中混匀

↓

把腹腔液滴加在洁净的载玻片上

↓

将载玻片置于带盖解剖盘中(盘底部放2~3盒湿沙布)

↓37℃培养箱孵育30min

取出玻片，漂洗去上清液和末粘附在玻片上的细胞

(漂洗标准: 在显微镜下检查无重叠细胞层，且水流不要过急以免将贴附在玻片上的MF冲掉)

↓室温下晾干或用吹风机吹干载玻片

Giemsa染液染色5~l0min

↓

冲洗去多余染液，晾干

↓

高倍镜或油镜下观察并计数计算出吞噬百分率和吞噬指数

[附]：吞噬百分率 = 吞噬鸡红细胞的MF数/MF总数′l00

吞噬指数 = MF吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的MF总数