HepG2转染的方法讨论

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总有一种转染方法适合你

geniusma问：

准备做hepg2的转染试验了，实验室常用的的是lipofectamine 2000，听说hepG2的转染效率很低，并且这种细胞比较容易成团，这会影响转染效率吗?是否用trypsin+EDTA 可以使其成为单个细胞不成团?哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗?如果用lipofectamine 2000，加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况，谢谢!

starry913认为：

HepG2用lipo2000在我们实验室做的转染效率很高的，可以到70-80%，不必担心。不需要用电转，磷酸钙法也可以有40-50%的

操作上主要注意：

1，细胞铺板时的状态很重要，应该在铺板前尽量消化为单细胞悬液，trypsin+EDTA充分吹打即可

2，转染前1天铺板，待转染时密度刚好达到80-90%，不能太低，但是也不能长过(细胞成团，堆积)。最好是刚刚长满，此时还在对数生长期

3，加入的质粒 要去除内毒素，plasmid：lipo约为1：0.5-1：5。实际上采用说明书的推荐量就很好，1：2.5

4，用前自己好好看一遍说明书，哈哈

yangea认为：

HepG2细胞的确相对于CHO等细胞而言转染效率比较低，但也只是相对。据我们实验室的经验，用lipofectamine 2000转染HepG2完全没有问题，无论是瞬时转染还是稳定转染，也无论是转一个质粒还是共转染两个质粒(转两个以上没有试过)。但有些问题需要注意一下：

1、lipofectamine 2000毒性比较大，所以建议转染6 h后换去转染培养基;

2、采用先铺板再转染的方式比采用同时转染的方式效率会高，但需根据实验需要设计，如果采用前种方式，细胞的汇合度一定要在80%以上再转染(说明书上好像是达到90%);

3、采用0.25%的trypsin+0.02%EDTA消化细胞传代，弯头吸管稍加吹打，可使细胞分散的很均匀，消化的时间一定要掌握好，时间不够不易吹下且对细胞造成机械损伤，消化过了成片脱落，再想吹打成单细胞悬液就不容易了;

4、根据脂质体介导细胞转染 的原理，在质粒提取时要除去内毒素，否则会降低转染效率;

5、对于转染时DNA和脂质体的量说明书上有个推荐的范围，DNA (μg)：Lipofectamine™; 2000 (μl)=1：0.5 ~ 1：5，可在此范围内设几个梯度摸索一下，从而找到最适比例;

6、转染时用于稀释脂质体和DNA的培养基一定是无血清的，血清会干扰转染，还有脂质体稀释液和DNA稀释液要充分混匀并孵育足够时间，以使脂质体将DNA颗粒包裹好进入细胞。

starry913认为：

隔天转染是最理想的，但这个条件和细胞生长速度，铺板密度，培养基条件相关，是要摸出来的。

首先你的克隆的增殖速度要较快，这个和你的细胞代数，此前的营养状况有关，有时多次传代后细胞状态会变差，贴壁时间过长，建议采用复苏后10-20代内的。我们还用过高血清(15%-20%)来调整生长速度，但是这点有时会改变细胞激活或基因表达状态，慎用

其次是接种密度。对于贴壁细胞我是不计数的，太麻烦，就算传代比例。一般1：2-1：3传代可以1天长满。必要时候增加量。但是如果生长过慢，单纯增加铺板密度也没什么意义，因为脂质体要求转染增殖期细胞的。此时还是要回到第一步去摸索。

10cm(60cm2)到6-well(10cm2)为6：1，按你的目前描述算下来大约是1：2传代，比较合适的密度，所以主要问题应该在你的细胞状态上。不知道你的克隆生长速度怎样?或者传代最后保留的Trypsin太多了，最好吸掉或者用较多Medium终止。消化时间对于细胞状态也很关键。

sdy352认为：

非常感谢starry913详细的解释。我的细胞一直长的很慢，故想在短时间内提高覆盖率。我也尝试洗掉trypsin，仍然不行。而且新的问题出来了，三天换一次培养基至9天时开始出现短杆状异物，疑为染菌。继续培养就知道是出现染菌了。但异物形态变为点状，生长速度极快。一两天就覆盖整个平板，现在很头疼，望大家不吝赐教。

richardmjf认为：

我也是在HepG2细胞的转染，听说这个细胞很不好转染，我师姐建议我用含有GFP标记的质粒转染，与目的质粒同时做，可以评价目的质粒的转染效率，然后再进行后面的实验。

1.转染没听说过用培养瓶做的，那样消耗脂质体太多了，脂质体1.5ml的就要3000多块，一个瓶里要加至少3 4ml培养基，你可以按比例算一下大约需要多少脂质体。

2.HepG2细胞长得比较慢，建议传代时密度稍微大一些，10000/孔(96孔板)应该算比较大了。第二天的时候细胞融合能到80%左右。我种板时用的不含双抗的含有胎牛血清的MEM培养基，到转染时把培养液吸去，先加入50μl不含血清不含双抗的MEM，然后加入用不含血清不含双抗的MEM稀释过的混合了质粒和脂质体的液体。6h左右后换液，加入含有10%胎牛血清和双抗的 MEM，继续培养。

3.不明白你的意思，“转染时加DNA或RNA时几微克是不是还需要换算阿?”你的质粒应该是浓度已知的比如*ug~H~8amp~Jmu~Jl，按照说明书的要求每孔加入*ug，那你就可以计算出你要加入的质粒有*ul。测定质粒弄得可以在紫外分光光度计上测定OD260，然后进行换算，应该是OD26undefined?~undefined稀释倍数=ug~Hml~A~N记不清了，RNA的应该是40)。

4.转染可以在96孔板中做，然后再做MTT就可以，转染不应该再培养瓶中做，太浪费了而且不能保证脂质体与质粒充分的作用于细胞。

祝你好运，我最近也在做，HepG2确实不好转，建议你先做一下预实验，然后摸索到好的条件在大批量的做MTT，我的惨痛教训，没做预实验直接进行下边的实验，一下做了40个孔，结果检测质粒根本没转进去，我的下边的试剂全都浪费了，将近80块钱呢。

erenda认为：

HepG2确实不好转，需要摸条件，可以先做预实验。脂质体转染试剂毒性比较大，建议用FuGENE HD或者罗氏专门转siRNA的，叫做X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent。X-tremeGENE适合转siRNA或与质粒共转。