求助：使用lipo3000向hepg2细胞内转染siRNA失败
dxy_j1fimif8
目前实验做了一个多月了，目的基因一直没有成功敲低过（在mRNA水平，蛋白水平未检测），阳性对照组GAPDH的敲低效率大概在50%左右。下面是具体的步骤（24孔板）
1.前一天使用无抗生素的完全培养基铺24孔板（细胞用量：一个24孔板大概用1/5-1/4个10cm皿细胞；也计过数每孔铺20-25万个细胞；每孔体积为450ul），第2天转染，在24小时内完成；
2.A：25ul opti-MEM + 1.5ul lipo 3000；
B: 25ul opti-MEM + 2.5ul siRNA (siRNA终浓度为100nM).
室温平衡5分钟，后将B管轻柔加进A管中，混匀室温孵育10-15分钟。
3.每孔取50ul AB混合液滴入24孔板中，轻晃混匀。
4.转染6小时后换含有双抗的完全培养基。
5.qpcr验证敲低效率（转染24小时，36小时都提过）
目前来看，效果都不理想，阳性对照只能敲低50%左右，目的基因在20-30%，siRNA是在吉满公司定的三保一，阳性对照敲不到70%不售后。请问我上面的步骤哪些地方需要改进啊，还有需要换转染试剂么，换什么比较好啊，救救孩子吧。
下面是在96孔板内转染cy3-siRNA的明场与荧光图（转染效率大概50-60%？）
4 个回答
huarenqiang5
你这个主要考虑是转染时间不够，建议延长转染时间看看。
sswei
可通过减少细胞密度，延长转染时间，更换转染试剂或培养基等方法，来提高实验效果。
毛利小五郎的徒弟
转染时间可以相应延长，或者增加一些促染剂
loveliufudan
根据你提供的实验步骤和结果，我可以提出一些可能需要改进的方面：
细胞密度：你使用的细胞密度可能需要调整。对于HepG2细胞，推荐的密度是每孔5-8万个细胞。如果使用的细胞太多，可能会影响转染效率。
转染试剂：你使用的是Lipo3000试剂，可能需要考虑更换其他转染试剂进行比较。例如，使用RNAiMAX试剂或者JetPRIME试剂等。需要注意的是，不同的试剂可能适用于不同的细胞类型，需要根据自己的实验条件进行选择。
SiRNA的浓度和效价：你使用的是100 nM的SiRNA，如果实验效果不理想，可以尝试调整SiRNA的浓度和效价。可以考虑减少SiRNA的浓度和效价，或者尝试使用其他供应商的SiRNA进行比较。
转染时间和培养时间：你目前的转染时间是6小时，可以考虑延长转染时间并观察效果。同时，你在转染后24小时和36小时进行了验证，也可以尝试延长培养时间进行观察。
培养基：你使用的是不含抗生素的完全培养基，需要注意培养基的质量和配制方法，避免对实验结果产生影响。
总的来说，转染SiRNA的效果受到很多因素的影响，需要根据实验条件进行细致的优化。可以尝试对细胞密度、转染试剂、SiRNA浓度和效价、转染时间和培养时间、培养基等方面进行优化，同时也需要合理设计对照实验来确定问题的原因。
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