cos-7的转染方法讨论

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问：cos-7的转染

1、细胞的培养：我们在培养细胞时发现该细胞长的很快，不到2天的时间就长满了;消化的时候老是成块的掉，如果消化时间加长，细胞也能成单个的，但是细胞的生长力又减弱了，请问要怎样来克服这一问题呢?

2、转染前：转染前16-24h我们用含血清不含抗生素的MEM传进6孔盘，16h左右就发现细胞贴壁了，但是形态没有以前好，并且漂死细胞相当多。最初我们都以为是细胞没有贴壁，又把细胞放进培养箱，结果死细胞越来也多，请问是不是因为没有抗生素所以细胞才很容易死，并且形态不好的呢?

3、转染：在6孔盘中我们用的是10μl脂质体2000，质粒 的量不太固定，但每次转染效果都是一样的，就是把脂质体-DNA复合物一加入6孔盘中，细胞就开始大量死亡。转染6h后用含血清不含抗生素的营养液换液，24h-48h几乎就看不到荧光，请问是什么原因造成转染效率那么低呢?

答：

vagrant110认为：

我现在一直在做COS-7的转染，一般转染效率都会在60—70%左右。

1.培养方面：细胞传代前，先用PBS 冲洗一下，以除去FBS，而便于后面的消化，一般一瓶细胞加1ml左右0.25%胰酶，37度放置2-3min，尽量不要晃动，否则细胞就会一片一片的掉落!

2.转染方面：准备转染之前，细胞以3X105每孔接种到六孔板中(以便于后期裂解)，一般长至第二天就可以做转染了，转染时，先将脂质体和质粒混匀到无抗生素无血清培养基(我用的是高糖DMEM )中，在脂质体说明书中说的是每个六孔板10μl，然后加4μg质粒，我一般都是按每孔5μl脂质体+4-5μg质粒+200μl无抗生素无血清DMEM，轻弹混匀，室温放置30-40min。然后将六孔板中的培养基吸出，PBS洗一遍，加入500μl，然后加入前面的混合液，转染4-6小时后，弃掉孔内液体，加入完全培养基，48h(48h荧光明显强于24h)左右即可裂解提取蛋白了。

介绍一下我自己的经验，望对你有所帮助，另祝实验早日成功!

medicalyouxia认为：

1.细胞培养方面：在细胞传代时，尽量将细胞一点点由里向外(从瓶底向口)吹下，有条件情况下过一下细胞筛，然后再接种。另外可以将细胞悬液移入离心管中，使离心管垂直静置，待细胞团块全部下沉后，将上部的细胞悬液移出进行接种，下部细胞团弃掉。还可以将细胞用D-Hanks冲洗一下，在瓶中加1ml左右的复合消化液0.125%胰酶+0.02%EDTA，室温放置片刻，中止消化后，可以将细胞吹成单细胞悬液.离心洗涤1次，再接种!!

2.细胞转染方面：准备转染之前，细胞以5X105每孔接种到六孔板中一般长24h后就可以进行转染，转染时，先将脂质体和质粒混匀到无抗生素无血清培养基中，根据脂质体说明书调整相应脂质体，质粒不含血清培养基的比例。一般都是按每孔5μl脂质体+4μg质粒+200μl无抗生素基础培养基，轻弹混匀，室温放置30min。然后将六孔板中的培养基吸出，加入2ml-hanks洗一遍，再加入500μl，最后加入前面的混合液，转染6小时后，弃培养上清，加入完全培养基，36h或48h可以进行相关的检测。