转染小分子RNAInvivofectamine 2.0和Neon系统

互联网2013-09-06

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说到转染，怎么能忘了Invitrogen ，也就是现在的Life Technologies呢?自1993年Lipofectamine™ 试剂上市以来，它一直是市场上卖得最火的转染试剂。直到后来Lipofectamine 2000、RNAiMAX、LTX上市，Lipo旋风越刮越猛。至于小分子RNA的转染，有Lipofectamine 2000和RNAiMAX两员猛将顶着，似乎可以高枕无忧，但Invitrogen还在开发更多的转染试剂和仪器，试图覆盖更广的市场。

有些百毒不侵的细胞，你还真拿它没办法，转染试剂就是不管用。这时，我们得换一招。你有两个选择：电穿孔和病毒。体验过的人都知道，用病毒作为载体来转染相当复杂。通常需要构建重组子，让它表达前体miRNA或shRNA，然后收集病毒粒子，转导细胞，在那里生成有功能的siRNA 或miRNA模拟物。如果顺利的话，大概需要几个星期。

电穿孔这种方法就相对简单一些，但你需要投入一台仪器。过去的说法是，这种方法毒性较大，诱导细胞膜上形成孔的电脉冲会杀死一定比例的细胞，因此，每次实验都需要一定量的细胞。

为了克服这些问题，Invitrogen 2009年推出了Neon系统。与传统的电穿孔仪器相比，它的独特之处在于用一个特别的移液器吸头取代了传统的电击杯。这样流程就简化了：只需将细胞和核酸吸入Neon™ 移液器吸头中，再插入到移液器吸头架上，即可开始。据Invitrogen介绍，由于电极的独特设计，表面积比标准电击杯要小，因此电穿孔更为温和，细胞存活率也更高。

目前，Neon已经成功转染了多个细胞系，包括原代星形胶质细胞、原代树突状细胞、Jurkat、小鼠胚胎干细胞等，在多数细胞类型中获得超过75%的转染效率。如果你们实验室的研究对象是干细胞或原代细胞，这确实是个不错的选择，就是价格不那么可爱，在12万左右。

前面说了这么多，都是转染细胞的，至于活体转染，虽不能说是处女地，也仍是各公司较少涉猎的领域。然而，很多动物模型的研究人员又急切盼望开发出活体转染的试剂。在N年前，就有人拿Lipofectamine 2000进行活体转染，效果似乎也还行。这么多年过去，Invitrogen终于顺应民心开发出了Invivofectamine。现在又升级为2.0版。

Invivofectamine 2.0试剂是一种专为siRNA导入而设计的活体RNAi转染试剂，无毒性和免疫刺激性，能够让研究人员在小的动物模型上开展高效的小RNA干扰实验。通过尾部静脉注射，Invivofectamine 2.0可将合成的siRNA带到肝脏，产生高水平的mRNA沉默。实验证明，Invivofectamine 2.0和附带的阳性对照Ambion In Vivo siRNA注入后，定向的基因沉默可持续三周以上。

实验过程也并不复杂(如下图)。只需将500 μl Invivofectamine 2.0和500 μl siRNA(1.5 mg/ml)混合后，在50℃孵育30分钟，再透析至生理条件，即可注射。

大家肯定很关心干扰的持续时间。研究表明，Invivofectamine 2.0-siRNA复合物的knockdown时间是取决于剂量的，同时也受siRNA分子稳定性的影响。研究人员曾注射了Invivofectamine 2.0试剂及两条序列相同的siRNA，一条是有着Ambion In Vivo siRNA修饰，另一条则没有修饰。下图显示Ambion In Vivo siRNA修饰的稳定性增强导致干扰的持续时间延长。

至于注射后siRNA的分布，Invitrogen也做过研究。正如预期，大部分siRNA在静脉注射后进入肝脏细胞，还有一些进入脾脏和肾脏。在肾脏中，冰冻切片显示标记的siRNA进入肾小球。有趣的是，如果是腹腔注射，那情况则有所变化。标记的siRNA会进入脾脏和胰腺细胞，以及肝脏，但数量会低于静脉注射。

Invivofectamine 2.0目前有两种规格：1 mL和5×1 mL，价格分别为14092和51917元。虽说大包装便宜些，不过有一点需要特别提醒，Invivofectamine 2.0的保质期只有6个月，算上订货那一个来月的时间，到手后估计只剩4个月，如果没把握在这段时间用完的话，还是不要买那么多了。