合成的小分子配体 R S L l 诱导的体外基因调节

合成的小分子配体 R S L l 诱导的体外基因调节

材料

试剂
氨 苄 青 霉 素（100 mg/ml 水溶液）

小 牛 血 清（Invitrogen)

要转染的细胞

二甲 基 亚 讽（D M S O ; Sigma-Aldrich)

配体： R S L l (5mmol/L 在 DMSO 中，室温下稳定， MW 382. 5) ( New EnglandBioLabs)

脂质体 2000 (Invitrogen)

突光检测系统（Bright-Glo; Promega)

核酸

可诱导的表达载体： pNEBR-Xl (NewEnglandBioLabs)

标准质粒： pRL-CMV (最佳的，见 步 骤 2a) (Prom ega)

受体载体： pNEBR-Rl (NewEnglandBioLabs)

细 菌（XLl-Bkie 或者其他的）含有质粒，培养在 L B 培养基中，加 100ug/ml 的氨苄青霉素。用于转染的质粒去内毒素，柱 式 纯 化（如 来 自 QIAGEN 的质粒抽提小试剂盒）或 者 CsCl梯度方法是合适的。

Opti-MEMI 培 养 基（Invitrogen) 或 者 无 血 清 培 养 基

PLB 裂 解 液（Promega)

TRIZOL 试剂 (Invitrogen) 或 RNeasy Kit (QIAGEN)

仪器

细胞培养板（本例中为 48 孔板)， 96 孔不透明检测板（VWR 或 Fisher Scientific)

微型离心管（1.7 ml)

微盘式冷光仪（Dynex Technologies, Inc.) 用于突光检测

平面振荡器

方法

转染

RheoSwitch系统与各种转染试剂是兼容的 ，包 括 脂 质 体 2000 (Invitrogen)、F u G E N E 6 (基因治疗系统) 、 SuperFect (Q I A G E N )、磷酸钙沉淀物。电穿孔和细胞核转 染 技 术（A m a x a B i o s y s t e m s) 能被使用。能 在 多 种 细 胞 培 养 板（96 孔板 、 48 孔 板 、24 孔板）上以较大的规模进行转染。在这里 ，脂 质 体 2000 用 来 在 48 孔板转染细胞，用 p N E B R -R l 作为受体载体， p N E B R -X l 含有虫萤光素酶作为可诱导的表达载体。程序可以根据使用情况修改。

1.如果使用贴壁细胞，在转染前一天接种细胞， 250M1 的培养液不加抗生素，这样在转染的时候细胞的汇合度为 80 % 〜90 % 。在含抗生素的培养基中使用 Lipofectamine 2000 会引起细胞毒性。

2 . 根据下面描述的方法准备 6 个孔的转染混合物，重复每个转染实验，统计学分析最后的结果。

a. 在 1.7ml 微 型 离 心 管 中 ，加 160ul 的 Opti-MEMI (或 者 无 血 清 培 养 基）， 加500ng 受 体 载 体（pNEBR-R l) 和 1.5 Mg 可 诱 导 的 表 达 载 体（pNEBR-X l) ， 稀释 RheoSwitch 系统质粒。

如果需要的话，可以加人由组成型启动子驱动对照报道基因，如海肾萤光素酶或者 lacZ，可以用于在孔之间校正转染效率和检测。加 人 50ng 校正质粒到微型离心管中。

b. 在另一个 1.7ml 微型离心管中加 6^1 的 Lipofectamine 2000 到 160ul 的 OptiMEMI (或者无血清培养基）中。

c. 室温下 5 min，合并稀释的 DNA 和稀释后的 Lipofectamine 2000，轻轻揽摔，静置 20min。

3 . 每个孔（共 6 个）加入 50jlJ 的转染混合物。

4 . 细胞板拿到培养箱中。

为优化转染效率，对不同的细胞株需要探索最佳的 DNA 的量以及 DNA 与 Lipofectamine2000 的比例。

配体诱导基因的表达。根据要得到的基因诱导水平，如下进行配体浓度试验，决定最佳的配体数量。

5. 5mmol/L R S L l (在 D M S O 中）储存液稀释成为不同的工作液。建议工作液浓度为0.8、4、20、100、 500umol/L 。

6.在细胞板孔培养液中每组工作液稀释 1000 倍（形成浓度为 0.8、4、20、100 和500nmol/L RSU )，混匀。准备要求体积的配体培养液。

7 . 在转染 4〜6 h 之后，从转染的细胞板孔移走培养基，加 250ul 的包含不同浓度配体培养液。

8 . 细胞板拿到培养箱。

目前的转染混合物不影响配体诱导基因的表达能力，并 且 ，在大多数情况下，没有必要从细胞板孔中移走含有转染混合物的培养液。当进行大量的转染检测时这是特别有用的。在这种情况下，上面的方案可做如下修改。

9 . 准 备 含 2 倍 希 望 浓 度 的 配 体 培 养 液（如 0.16nmol/L、 8nmol/L、 40nmol/L、200nmol/L、 lumol/L RSLl 配体)。

10. 重复转染见前面的步骤 1、 2。

11. 接种转染混合物形成 DNA-Lipofectamine 2000 复合物后，从细胞板孔中移走培养液，添加 75ul的新鲜培养液。

12. 每个细胞板孔分配 5 0ul的转染混合物，轻轻振荡细胞培养板（每孔共 125ul 的培养液)。

13. 加 125 ml步骤 9 准备的含 2 倍稀释浓度配体的培养液。

配体会被稀释到原始浓度的一半。不需要在步骤 12、 13 间培养细胞。
H . 轻轻振荡细胞培养板，拿到培养箱。

检测诱导的基因表达

在 mRNA 水平，基因的诱导表达能在配体处理后的几个小时内被检测，或者用一个高灵敏度的方法，如化学爱光或者绿色荧光蛋白（G F P ) , 在蛋白质水平检测。配体处 理 24 h 后 ，表达量足够大，在 48〜72 h ，表达量达到最大。没有必要更换培养液或添加更多的配体 (除非培养液被换掉）。

15.在 mRNA 7jC 平检测诱导基因，从细胞中分离总的 RN A 然后进行 N orthern 杂交，或者反转录 RN A 然后进行实时荧光定量 PCR。用于转染的板的格式根据 R N A 的分离方法选择。分离 RNA，使 用 TRIZOL 试剂或 RNeasy Kit。