质粒 D N A 的体外转染

质粒 D N A 的体外转染

材料

试剂

A 7R 5 细 胞 ，鼠 平 滑 肌 细 胞 系（American T y p e Cell Culture [A T C C ])

用含 1 0 % 胎牛血清的 DMEM (Dulbecco minimal essential medium) 培养基在 37。 0.5%

CO2 的培养箱中培养。

生 长 培 养 基 和 胎 牛 血 清（F B S ) (HyClone Laboratories)

邻硝基苯基-卩-D ■ 半 乳 糖 吡 喃 糖 苷（O N P G )

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S )

质 粒 D N A ， p S V -p-glactosidase 对 照 载 体（6821b p , Promega)

terplex 复合物

通过改变P L L 或 L D L 制备不同的复合物。室温下，在 P B S溶液中混合十八烷基化 PLL[通过硬酯溴AT-烷基化 PLL (M.W. 50 0 0 0 ) 合成]和不同量的LDL (更详细的内容请参考 Kim et al.1998b)。

仪器

细 胞 培 养 箱 ，控 制 在 5 % C 0 2 (如 N a p c o , Precision Scientific)

分 光 光 度 计

方法

1 . 在 转 染 前 一 天 ，在 2 4 孔 板 以 2 X IO⁴ 个 /m l 的 浓 度 接 种 A 7R 5 细 胞 ，在 37°C ， 5 %
C O 2 下 培 养 。

2 . 固 定 质 粒 D N A 的 用 量 ，在 P B S 溶 液 中 将 D N A 与 含 有 各 种 成 分 的 terple x 混 合 ，并使 2 4 孔 板 每 孔 用 于 一 次 转 染 的 D N A 用 量 为 lug。

最好在转染前新鲜制备！

3•在每孔中加入40ulDNA溶 液（作为对照）或含PLL、 LDL和质粒DNA的 terplex。

4•在 37°C ， 5 % . C〇2 的条件下培养细胞 48 h , 经 PBS溶液洗涤3 次 ，收 集细胞用 于 检测 β -半乳糖苷酶活性。

5• 以 O N P G 为 底 物 ，用 分 光 光 度 计 在 420n m 检 测 转 染 细 胞 的 β-半 乳 糖 苷 酶 活 性 。

寡核苷酸 D N A 的体外转染

材料

试剂

A 7R 5 细胞，鼠平滑肌细胞系（A m e r i c a n T y p e Cell Culture [A T C C ])

用含 1 0 % 胎牛血清的 DMEM (Dulbecco minimal essential medium) 培养基在 37°C ， 5 %C〇2的培养箱中培养。

CCD-32 L u ，人肺纤维原细胞系（A T C C )

用 含 1 0 % 胎 牛 血 清 的 EMEM (Eagle’s minimal essential medium) 培 养 基 在 25 mm2 的聚苯乙 烯 组 织 培 养 瓶（T-25培养瓶， Falcon) 培养。胰蛋白酶消化，重悬用于实验。

生 长 培 养 基 和 胎 牛 血 清（F B S ) (HyClone Laboratories)

M T T (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl3-2, 5-diphenyltetrasodium bromide) CSigmaAldrich)

寡核苷酸
r m y b 反义寡核苷酸（I8m e r ， 5^ G T G T C G G G G T C T C C G G G C -3’)搭 配 不 当（m i s m a t c h e d) 反 义 寡 核 苷 酸（18m e r ， 5 ‘-G T C T C C G G C T C AC C C G G 〇 3，）

反义寡核苷酸由Midland Certified Reagent Co•通过亚憐胺化学法合成，并通过凝胶过滤纯化

terplex复合物

通过改变寡核苷酸的用量制备不同的复合物。

室温下，在 PBS溶液中混合十八烷基化PLL [通过硬酯溴N -烷 基 化 PLL OVL W. 50 000合 成 ]和 固 定 量 的 LDL，以及变化量的寡核苷酸，来制备稳定的terplex复 合 物（更详细的内容请参考Kim et al.1998b)。

仪器

细 胞 培 养 箱 ，控 制 在 5 % C 〇2 (如 N a p c o ， PrecisionScientific)

方法

1.在转染前一天，以 5 X 10⁴ 个细胞/孔的密度在9 6 孔板接种 A 7R 5 或 C C I >32 L u 细胞 ，在 37°C ， 5 % C O 2 浓度下培养过夜。

2.通过改变寡核苷酸D N A 的量制备不同 terplex复合物。

最好在转染前新鲜制备！

3.将 terplex复合物加人到培养的细胞，在37℃， 5 % C0 2 下培养细胞4h，包括含血清和不含血清两种情况。

4• 利 用 M T T 法 分 析 细 胞 增 殖 的 情 况（M o s m a n n 1 9 83)。

体内动物实验

材料

试剂

丁 丙 诺 啡（buprenorphine)

异 氟 焼 Gsoflurane)

克 他 命（ketamine) (50m g /k g ，肌 肉 注 射）

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S ， p H 7. 4)

质 粒 D N A ， p C M V - V E G F

质 粒 D N A 通 过 双 CsCl 梯度纯化，并 通 过 A 26qM 28。和 0 . 8 % 琼脂糖凝胶电泳确认。

兔 ， N e w Z e a l a n d W h i t e (2. 5〜 3. 5k g ) (W e s t e m O r e g o n )

染 色 溶 液

苏 木 精 和 曙 红（hematoxylin and eosin， H & E )

trichrome

甲 苯 噻 嗉（xylazine) (8. 8m g / k g ，肌 肉 注 射）

仪器

血 管 插 管（angiocatheter)

心 电 图 扫 描 仪

针 头（3 0 号 )

呼 吸 机（rodent ventilator， Harvard Apparatus)

Standard planimetry 软 件（N I H I m a g e )

缝 合 线（5-0 Prolene)

超 声 心 动 图 显 影 系 统（General Electric Vivid Five or Hewlett-Packard 5500)

方法

I. 给 新 西 兰 白 兔 喂 镇 静 剂 ，选 取 质 量 在 2. 5 〜 3. 5k g 的 白 兔 ，肌 肉 注 射 克 他 命（50m g /k g ) 和 甲 苯 噻 嗪（8. 8m g /k g ) 。刮 掉 兔 子 的 毛 并 把 管 子 插 到 它 们 的 气 管 中 。

所要准备的动物数量视研究目的确定。随机地分配这些动物到实验组或对照组（见 步 骤 6)。

2 . 在无菌華件下对每只动物的左胸用异氟醚进行外科手术麻醉。将动物固定在呼吸机上，呼吸速度为 6 0 % 和 4 0 % F i O 2

3.将左胸廓切开，缩进肺，打开心包膜。

4•在旋动脉的第一个分支周围放置一个 5-0 缝合线，实 施 IO s 闭塞测试来确定心室区 域 。

5 . 准备注射液。对于每只实验组动物，准备 500ul注射液，其中含 50ugLDL， 50 ug十八 烷基化P L L 和 50 ugpCMV-VEGF， 溶 于 PBS (PH 7 . 4 ) 中 。对于每只对照组动物 ，准 备 500ulP B S 注射液，含 50ug L D L 、 50 ug 十 八烷基化P L L 。

注射液最好新鲜配置。

6 . 在心肌内插人 3 0 号针头，分 4 次（每 次 1 2 5 ul ) 注射准备好的注射液到每只实验动物。

7.注射后，马上按照 Affleck 等（2001) 描述的方法诱导心肌梗死。通过目测和心电图改变判断心肌是否萎缩。

8.经过一段时间的观察后，临时封闭气体呼出，使肺部膨胀。用插管疏散胸膜内残留的空气。

9.缝合肋骨和肌肉层以及皮肤。

10.待实验动物能自然呼吸时，拔出呼吸机管。手术后 48 h 内，每 12 h 注射一次丁丙诺啡（0. 05m g /k g ，肌肉注射）止痛。

11•用克他命（20m g /k g ) 和 甲 苯 噻 嗪（5m g /k g ) 轻微麻醉兔子，在手术后的第 1 天和 第 21 天记录实验动物的心电图。

在我们的研究中.，用心回波图作为处理组的盲性对照。

12•用 Hewlett-Packard 5500 或 General Electric Vivid Five 收集图像，使用 12M H z 的探针在我们的实验中所有的呈像均由一个有经验的超声波心动描记分析员获取，并由另一个有经验的超声波心动描记分析员进行核实，以保证不同观察者之间以及同一观察人对不同成像的之间的可靠性。胸骨右侧旁的长轴方向被用于排出量分数的二维测量。二维测量的排
出量分数通过人工记录心脏舒张期结束时和心脏收缩期结束时心室面积的变化来获得。测量时每组数据重复 3〜5 次，其平均值作为实验结果。胸骨右侧旁的短轴方向用于表征底部的环状结构，中等大小的乳状突起结构和顶点。 M 模式测量从每一水平的部分收缩变化中求得，这样就计算出了排出量分数。报道的报出量分数，部分收缩变化以及左心室收缩和舒张面积代表这些数值的平均值。

13.术后第 21 天 ，通过克他命和吸入异氟烷的方法麻醉实验班动物，放血处死。

1 4 . 用 IOOml 常规生理盐水从主动脉根部灌注，并将心脏经中性缓冲福尔马林加压[IOOmmHg (Im m H g=I. 33 322X102P a ) ] 灌注固定。

1 5 .从短轴方向每 5m m 石蜡包封切片，苏木精和曙红染色。

16•使用 Standard planimetry software ( N I H I a m g e) 测量正常的和梗死的左心室心肌
面积。
■ 左心室心肌梗死百分数等于左心室心肌梗死面积（所有切片）除以左心室心肌总面积，然后乘以 100。