哺乳动物DNA:Southern印迹杂交技术实验

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本文主要介绍了利用Southern印迹杂交技术来获得DNA分子中基因编码区的大小和位置的实验原理、方法步骤。主要分成待测核酸样品的制备和 琼脂 糖凝胶电泳分离待测DNA样品两部分。
 

Southern印迹杂交仪器

实验原理

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳 和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子 通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法;滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RFLP)等。

实验方法

本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。

一、 待测核酸样品的制备

(一) 制备待测DNA

基因组DNA是从动物组织(或)细胞制备。1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞;2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA;3. 用有机试剂(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白质。

(二) DNA限制酶消化

基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。

消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。

二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品

(一) 基本原理

Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。

在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70-80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。

琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛作用。在相应的电泳缓冲液中，DNA在电场的作用下由负极向正极泳动，分子越大，泳动速度越慢;反之，分子小则泳动速度快，而大小相同的分子则泳动速度相同。因此在恒定的电场下，经过一段时间电泳后，DNA按分子大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA (DNA marker)进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。

在制备凝胶和电泳过程中需要注意的几个问题是：第一、尽可能在使用之前配制新鲜凝胶;第二、如果使用的胶比较薄，铺胶后1h内使用;第三、胶中不要含有EB，否则会引起非特异性背景;第四、电泳结束后用1μg/ml的EB染色，然后用水脱色(如果胶里含的是RNA，则使用无RNA酶的水)，以保证核酸的完整性。

(二) 基本步骤

1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。

DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。