Southern印迹

【原理】

Southern 印迹是将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。

DNA 分子经限制性核酸内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳将得 DNA 片段按分子量大小分离，然后将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶变性，并将单链 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上，而各 DNA 片段的相对位置保持不变，这种滤膜可用于杂交反应。利用 Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析 (RFLP)等。

【操作】

(1)取一定量的待测 DNA 样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA 的量根据样品的种类及目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取 0.1 ～ 0.5 μ g 即可；而对于鉴定基因组 DNA 中的单拷贝基因顺序，则需要 10 ～ 20μg ；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要多至 30 ～ 50 μ g 。酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳，在其中 1 孔中加入适当的 DNA 分子量标准参照物。电泳结束后，溴化乙锭 (EB)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用 1 张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各 DNA 样品带的位置，在凝胶旁置 1 标尺照像。

(2)切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切除，以便于定位，然后将凝胶置于一搪瓷盒中。

(3)将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放 1 小时使之变性，不间断地轻轻摇动，对于较大的 DNA 片段 (如大于 15kb)，可在变性前用 0.2mol / L HCl 预处理 10 分钟使其脱嘌呤后，再进行碱变性处理。

(4)将凝胶用去离子水漂洗 1 次，然后浸泡于适量的中和液中 30 分钟，不间断地轻轻摇动。换新鲜中和液，继续浸泡 15 分钟。

(5)如图 8-1 所示，在一塑料或玻璃平台上铺一层 Whatman 3mm 滤纸，此平台要求比凝胶稍大。将此平台置于一搪瓷盒或玻璃缸中，搪瓷盒中盛满 10 × SSC 。滤纸的两端要完全浸没在溶液中，将滤纸用 20 × SSC 湿润，用一玻璃棒将滤纸推平，并排除滤纸与玻璃板之间的气泡。

(6)裁剪一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套，千万不可用手触摸，否则油腻的膜将不能湿润，也不能结合 DNA 。

(7)将硝酸纤维素滤膜漂浮在去离子水中，使其从底部开始向上完全湿润。然后置于 20 × SSC 中至少 5 分钟。注意滤膜如果不能被湿润则不能用。

(8)将浸泡好的凝胶上下颠倒后，置于上述铺了一层 Whatman 3mm 滤纸的平台中央。注意两者之间不要有气泡。

(9)在凝胶的四周用 Parafilm 蜡膜封严，以防止在转移过程中产生短路 (转移液直接从容器中流向吸水纸而不是经过凝胶 )，从而使转移率降低。

(10)将湿润的硝酸纤维膜小心覆盖在凝胶上，膜的一端与凝胶的加样孔对齐。排除两者之间的气泡。相应地将膜的左下角剪去。注意膜一经与凝胶接触即不可再移动，因为从接触的一刻起，DNA 已开始转移。

(11)将两张预先用 2 × SSC 湿润过的与硝酸纤维素膜在大小相同的 Whatman 3mm 滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，排除气泡。

(12)裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸，约 5 ～ 8cm 厚。将之置于 Whatman 3mm 滤纸之上。在吸水纸之上置一玻璃板，其上压一重约 500g 的物品。

(13)静置 8 ～ 24 小时使其充分转移，其间换吸水纸 1~2 次。

(14)弃去吸水纸和滤纸，将凝胶和硝酸纤维素膜置于 1 张干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置。

(15)凝胶用溴化乙锭染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡在 6 × SSC 溶液中 5 分钟，以去除琼脂糖碎块。

(16)硝酸纤维素膜用滤纸吸干。然后置于两层干燥的滤纸中，真空下 80 ℃烘烤 2 小时，此过程使 DNA 固定于硝酸纤维素膜上。

(17)此硝酸纤维膜即可用于下一步的杂交反应。如果不马上使用，可用铝箔包好，室温下置干燥处保存备用。

(18)如用于杂交，杂交方法见实验三十二。

【器材】

琼脂糖电泳装置：真空泵；真空烤箱；其它实验室常规仪器及试剂。

【试剂】

适当的限制性核酸内切酶

琼脂糖

变性液： 1.5mol/LNaCl ； 0.5mol / L NaOH 。

中和液： lmol / L Tris-Cl （pH8.0 ）； 1.5mol / L NaCl 。

转移液（20 × SSC ）： 3mol / L NaCl ； 0.3mol / L 柠檬酸钠，pH7.0 。

硝酸纤维素膜或尼龙膜