Southern印迹技术

Southern印迹技术（Southern blot）是将DNA转移到固相支持物上，然后与存在于液相中的标记探针进行杂交的过程。

Southern印迹技术可检测特定大小DNA分子的含量，常用于克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。

Southern印迹技术的基本原理是首先将限制性核酸内切酶消化的DNA片段经凝胶电泳分离，然后使凝胶上的DNA变性，并在原位将单链DNA片段转移至硝酸纤维素膜或其他固相支持物上。

通过用放射性同位素标记特异的DNA探针，与单链DNA片段进行杂交反应，经放射性自显影，分析杂交信号，确定与探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

Southern印迹技术常用于克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。

器材：

①电泳仪、电泳槽、制胶模、梳板、玻璃板、托盘

②紫外分光光度计、紫外检测仪

③离心机、恒温水浴箱、真空烤箱

④硝酸纤维素滤膜、Whatman 3MM滤纸、吸印纸、保鲜膜、杂交袋

⑤微量移液器（20 μl）、枪头（灭菌）、1.5 ml Eppendorf 管（灭菌）

⑥放射自显影盒、X线胶片

试剂：

①材料：基因组DNA、已标记好的探针

②限制性核酸内切酶及缓冲液

③DNA分子质量标准（Marker，1kb梯度）

④琼脂糖、5 x TBE

⑤10 mg／ml EB（溴化乙锭）

⑥20 x SSC、6 x SSC、2 x SSC和0.1 x SSC

⑦50 x Denhardt＇s 溶液

⑧6x加样缓冲液、变性溶液、中和溶液、预杂交溶液

⑨0.1％ SDS

Southern印迹的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）5xTBE（Tris-硼酸-EDTA电泳缓冲液）800ml H₂O溶解54.0 g Tris，27.5 g硼 酸，20 ml 0.5 mol／L EDTA（pH 8.0），再用H₂O定容至1 L。

（2）6x加样缓冲液 0.25％ 溴酚蓝，0.25％ 二甲苯青，40％ 蔗糖溶液，4 ℃保存。

（3）变性溶液 1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH。

（4）中和溶液 1.5 mol／L NaCl，1 mol／L Tris-HCl（pH 8.0)。

（5）20 x SSC 800 ml H₂O溶解175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，14 mol／L HC1调节 pH至7.0，用H₂O定容至1 L，终浓度为3 mol／L NaCl、0.3 mol／L柠檬酸钠。

（6）6 x SSC、2 x SSC和0.1 x SSC 用20 x SSC稀释。

（7）50 x Denhardt＇s 溶液：1％ Ficoll-400，1％ PVP（聚乙烯吡咯烷酮），1％ BSA（牛血清白蛋白），过滤除菌后于-20 ℃储存。

（8）预杂交溶液 6 x SSC，5 x Denhardt＇s 溶液，0.5％ SDS，100 mg／ml鲑鱼精子DNA，50％ 甲酰胺。

（9）杂交溶液 预杂交液入标记好的探针即为杂交液。

（10）20％ SDS 900 ml H₂O溶解200 g SDS（加热到68 ℃并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解），浓HCl调节pH至7.2，用H₂O定容至1 L，室温保存。使用时按比例稀释。

（11）EB（10 mg／ml）在100 ml水中加入1 g EB，磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解。然后将溶液转移至棕色瓶中，保存于室温。

(12)TE 10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

（二）基因组DNA的消化

（1）按下列方法准备一个50 μl的反应体系：基因组DNA 20 μg，限制性核酸内切酶缓冲液适量，灭菌水适量，置于4 ℃数小时，期间温和地搅动DNA溶液数次，加入限制性内切酶（5U／μg，以DNA计），补足50 μl体积。

（2）4 ℃温和地搅动溶液2～3 min，再升温至酶切反应需要的温度，孵育8～12 h。

（3）消化结束后用乙醇沉淀法浓缩DNA片段，将DNA 溶于10 μl TE中，测定其OD值。

（三）琼脂糖凝胶电泳

（1）用0.5 x TBE缓冲液配制0.7％ 的琼脂糖凝胶，加热使琼脂糖彻底热融，待冷却至50 ℃时，在凝胶中加入EB至终浓度为0.5 μg／ml。

（2）将融化的凝胶倒入制胶模中，梳板置于一端，底部与制胶模之间留下0.5～1 mm间隔，凝胶厚度在3～5 mm之间。

（3）待凝胶凝固后，将制胶模放入电泳槽内，并向其中加入0.5 x TBE电泳缓冲液，液面高出凝胶表面1～2 mm，小心拔出梳板。

（4）将DNA消化产物（每个加样孔不少于10 μg）与其1／5体积的6x加样缓冲液混合后，用移液器加到样品孔中。选择1kb梯度的DNA分子质量标准（Marker），将5 μl Mark-er加在凝胶的最外侧样品孔中。

（5）接通电源线，样品孔处于电泳槽的阴极端，开启电源开关。调整电压为1 V／cm，在琼脂糖凝胶中电泳12～24 h。

（6）将凝胶放在紫外灯下，观察DNA电泳条带，照相记录。

（四）转移

（1）将凝胶在加样孔一侧切去一角，作凝胶方位标记。再放进盛有变性缓冲液的盘中变性处理2次，每次15 min，轻轻摇动。

（2）将凝胶转移到中和缓冲液中中和30 min，轻轻摇动。

（3）裁1张硝酸纤维素膜，2～4张3 MM滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。

将硝酸纤维素膜剪下一角做相应的方位记号，然后先用无菌水完全湿透，再用20 x SSC浸泡。接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴棉布手套操作。

（4）在转移盘中放一块比胶大的平板，上面铺一张3 MM滤纸，滤纸两边浸泡在20 x SSC缓冲液中。去除滤纸与平板之间的气泡。

（5）将凝胶放置在滤纸上，使其电泳时向上的一面朝下，去除两层之间出现的气泡。然后将浸湿的硝酸纤维素膜一次准确铺在胶上，对齐。

铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。再用2张浸过2 x SSC缓冲液的3 MM滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，同样要把气泡赶去。

（6）把一叠干的吸印纸放置在3 MM滤纸上，在吸纸上再放一块玻璃板，加压约500 g重物（如图所示）。

（7）转移 上述步骤完毕，开始进行DNA转移。通过滤纸的吸附作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上。根据DNA复杂程度，转移2～24 h。

简单的印迹转移需2～3 h；对于基因组大片段DNA，一般需要较长时间的转移。期间如果吸印纸过于潮湿，应换新的干燥的吸印纸。

（8）固定转移后，取出硝酸纤维素膜，浸泡在6 x SSC溶液中5 min以去除琼脂糖凝胶碎块。空气干燥膜片，然后在真空烤箱内80 ℃ 烘烤2 h。烘过的膜可在室温下干燥保存，待杂交。

（五）预杂交

将转移DNA的硝酸纤维素膜放入塑料袋内，加入预杂交液（约200 μl／cm²），前后挤压塑料袋，使硝酸纤维素膜湿透。排除袋中的气泡，然后将塑料袋密封，于42 ℃水浴中孵育2～4 h，弃去预杂交液。

（六）杂交

向塑料袋中加入杂交液（预杂交液加入标记好的探针即为杂交液），重新将其密封。然后置于42 ℃水浴中杂交16～24 h。

（七）漂洗

（1）弃去杂交液，取出硝酸纤维素膜，在室温下，用2xSSC／0.1％ SDS溶液漂2次，每次15 min。

（2）室温下，用0.1 x SSC／0.1％ SDS溶液漂洗2次，每次 15 min。

（3）55 ℃，用0.1 x SSC／0.1％ SDS溶液漂洗2次，每次30 min。

（八）放射自显影

（1）漂洗后的硝酸纤维素膜，经空气干燥，用保鲜膜包好。

（2）在暗室中，于胶片盒内在膜两侧各压上1张X线胶片，-70 ℃放射自显影。时间视杂交强度而定，24 h～10 d不等。通常曝光1～2 d后可见DNA谱带。

（九）实验结果及分析

（1）电泳结束后，应在紫外线下仔细观察DNA酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA样品有无降解、DNA带型是否清晰、有无拖尾及边缘是否模糊等现象，确认一切正常后再做转移及杂交。

（1）EB是一种诱变剂，皮肤长期接触易发生皮肤癌。因此在操作EB时应戴上聚乙烯手套防护。

（2）DNA片段的大小决定了其转移的速度。大于15 kb的DNA片段转移时间长且转移不完全，因此对于大片段DNA的转移，可先用0.2 mol／L HC1处理15 min，脱嘌呤。但处理时间需严格掌握，过长会使DNA降解为小片段，影响转移及杂交。

（3）操作凝胶及硝酸纤维素膜时，要戴上棉布手套，以防止脏物和油脂污染，导致转移失败。

（4）不能使硝酸纤维素膜上的滤纸接触到凝胶下的滤纸，否则形成短路流动使转移不均。可用保鲜膜将凝胶边缘封围。

（5）将硝酸纤维素膜铺在凝胶上时，膜一经与凝胶接触即不可再移动。因为从接触的一刻起，转移就已经开始。

（6）杂交时，不要留过多面积，浪费预杂交液及杂交液，同时塑袋内不要留有气泡，否则预杂交及杂交都不均匀。

（7）孵育前，检查塑料袋是否密闭，勿使袋内液体流出，以及水浴箱内液体流入。

（8）漂洗强度可根据所杂交的分子大小、同源区段的大小来确定，可适当调节漂洗液强度（改变离子强度）、漂洗温度和漂洗时间，同时亦可用放射性测定仪检测漂洗情况。

（9）在杂交及放射自显影过程中，应戴上手套防护。杂交了同位素的膜片用保鲜膜包裹好，不要污染其他器皿。