Southern印迹技术实验操作方法

相关专题

 

实验原理:

Southern印迹是将DNA 片断从电泳凝胶上直接转移至膜支持物(如硝酸纤维素膜、尼龙膜)上，使DNA片断固定的技术。先将DNA经限制性内切酶消化成一系列片段，进行琼脂糖凝胶电泳，各片段因分子量不同而彼此分开，然后经碱处理凝胶，使DNA的片段被变性、中和并通过毛细作用在高盐缓冲液中在原位将单链核酸转印到硝酸纤维膜上，烘干、固定。

试剂和器材

一、试剂

变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材

22cm×15cm瓷盘

操作方法

1. 在琼脂糖 凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相(放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离)。

2. 将凝胶 置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板(或一块海绵)使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1―2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。

7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。

8. 把一叠吸水纸(或卫生纸，约有5―8cm高，略小于滤纸)，放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。

9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。

11. 把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时。

注意事项

(1)将凝胶中和至中性时，要测pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

(2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。