用PCR-SSCP 区分不同来源的幽门螺杆菌

 

用PCR-SSCP 区分不同来源的幽门螺杆菌

幽门螺杆菌（Hp）感染在人群中广泛存在，Hp的分型鉴定对其感染的临床及流行病学研究具有重要意义。国外文献报道的几种基因型技术使Hp的分型鉴定成为可能，而PCR及单链构象多态性（Signle-strand conformation polymorphisms,SSCP）分析在菌株分型鉴定中的应用则尚未见报道。作者采用PCR-SSCP分析区分不同来源的Hp，并探讨其应用价值。

1 材料和方法

　　1.1 菌株来源 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848来自英国伦敦国家标准培养物收藏中心，由本院传染科保存并提供；112株临床分离鉴定的Hp来自97名因上胃肠症状在本院行胃镜检查的病人，经内镜及病理诊断证实十二 指肠溃疡49例， 胃溃疡 5例， 慢性胃炎 43例。所有病人在内镜直视下于胃窦取粘膜活组织一块做细菌培养，其中包括1例未经治疗相融8个月复查胃镜者，4名病人还另于胃底或十二指肠球部取粘膜活组织一块做细菌培养，10例十二指肠溃疡伴Hp感染者于抗生素治疗停药4周复查胃镜，取胃窦粘膜活组织两块分别做细菌培养及PCR方法直接检测Hp。

1.2 模板DNA的准备 培养细菌或研碎的活检胃粘膜以1%SDS100μg/ml蛋白酶k，55°C消化1h，以等体积苯本分氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提，12000rpm离心10，吸取上层水相，加2.5倍体积冷无水乙醇12，000rpm离心10min沉淀DNA，以100μl无离子溶解DNA，1μl用于PCR扩增。

　　1.3 PCR扩增Hp 基因组 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’，已证实对HpDNA特异，扩增片段长度为203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mM Mgcl2,0.01%明胶，各200μdNTP，各0.5μM CAM-2/CAM-4引物，1.25U TaqDNA聚合酶（中科院遗传所产品）。反应条件：94°C5min,1个循环；94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35个循环；72°C10min，1个循环。以HpNCTC11637DNA为阳性对照，去离子水做阴性对照。

1.4 PCR产物的SSCP分析 PCR产物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C变性10min,加3μl电泳加样缓冲液（95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯腈蓝）混匀，于7.5%聚丙烯酰胺胶室温电泳300V，3.5min，以0.19%硝酸银染色30min，经显色液（1.5%NaOH,0.5%甲醛，0.0085%硼氰化钠）显色后观察结果，比较不同Hp菌株两条单链DNA片段的迁移情况。

2 结果

2.1 PCR-SSCP方法的重复性 相隔半年转种得到5对Hp菌株，每对菌株203bpPCR产物的SSCP分析均显示完全相同的单链构象；同一菌株203bp PCR产物在不同聚丙烯酰胺胶上都呈现相同的单链构象，使不同凝胶上菌株的PCR-SSCP分析具有可靠性。

2.2 Hp基因组DNA203bp片段SSCP分析 不同Hp菌株203bp片段变性后的两条单链，在中性聚丙烯酰胺胶中电泳的迁移率不同，从而形成不同的单链构象。来自97名病人的分离菌株及2株标准菌株产生7种不同的单链构象。通过比较不同的单链构象。通过比较不同Hp菌株的单链构象，将这97名病人的菌株分成6组（见表1）。同一病人相隔8个月分离培养的菌株，其203bpPCR产物的单链构象稳定不变；4个病人不同培养部位的4对Hp菌株分别具有相同的单链构象。

表1 Hp标准菌株来自97名病人的临床分离菌株的分组情况

组别 菌 株 来 源 菌株总数 总百分数（%） 十二指肠溃疡 胃溃疡 慢性溃疡 标准菌株 1 32 5 35 1 73 73．74 2 10 0 6 0 161 6．16 3 3 0 1 0 4 4．04 4 2 0 1 0 3 3．03 5 1 0 0 0 1 1．01 6 1 0 0 0 1 1．01 7 0 0 0 1 1 1．01

2.3 治疗前后菌株的PCR-SSCP分析10例Hp感染者抗生素治疗后停药1月或1月以上复查，发现6例细菌培养仍为阳性，4例细菌培养阴性而PCR检测仍为阳性。对这10例病人治疗前后菌株的PCR-SSCP分析，发现9例病人治疗前后的菌株具有相同的单链构象，1例病人治疗前后的单链构象不同。对其中2例治疗后仅PCR为阳性的患者，于停药5个月～6个月复查时发现细菌培养转为阳性，并与治疗前菌株具有相同的单链构象（表2）

表2 10例Hp感染者治疗前后菌株的PCR-SSCP分析

临床诊断_停药间隔 菌株*_PCR~FSSCP分组 DU 　 93060B 1 　 4周 9367a 1 　 5个月 94123A 1 DU 　 93018B 1 　 4周 9385a 1 NUD 　 93035B 2 　 4个月 93104A 1 GU 　 93077B 1 　 4周 9348A 1 　 6个月 94124A 1 DU 　 93026B 1 　 4周 93046A 1 NUD 　 93020B 3 　 4周 93036A 3 DU 　 93028B 4 　 6周 93055A 4 DU 　 93086B 1 　 4周 94114A 1 DU 　 93089B 1 　 4周 9392a 1 DU 　 93017B 2 　 4周 93032A 2

　　表2中同时列出不同组别菌株的疾病来源，未发现不同组别的菌株与某一疾病有确定的关系，未发现与十二指肠溃疡或 胃溃疡 密切相关的Hp菌株。