用PCR-SSCP 区分不同来源的幽门螺杆菌

1 材料和方法

1.1 菌株来源 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848来自英国伦敦国家标准培养物收藏中心，由本院传染科保存并提供；112株临床分离鉴定的Hp来自97名因上胃肠症状在本院行胃镜检查的病人，经内镜及病理诊断证实十二指肠溃疡49例，胃溃疡5例，慢性胃炎43例。所有病人在内镜直视下于胃窦取粘膜活组织一块做细菌培养，其中包括1例未经治疗相融8个月复查胃镜者，4名病人还另于胃底或十二指肠球部取粘膜活组织一块做细菌培养，10例十二指肠溃疡伴Hp感染者于抗生素治疗停药4周复查胃镜，取胃窦粘膜活组织两块分别做细菌培养及PCR方法直接检测Hp。

　　1.2 模板DNA的准备 培养细菌或研碎的活检胃粘膜以1%SDS100μg/ml 蛋白酶 k，55°C消化1h，以等体积苯本分氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提，12000rpm离心10，吸取上层水相，加2.5倍体积冷无水乙醇12，000rpm离心10min沉淀DNA，以100μl无离子溶解DNA，1μl用于PCR扩增。

　　1.3 PCR扩增Hp基因组 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’，已证实对HpDNA特异，扩增片段长度为203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mM Mgcl2,0.01%明胶，各200μdNTP，各0.5μM CAM-2/CAM-4引物，1.25U TaqDNA 聚合酶 （中科院遗传所产品）。反应条件：94°C5min,1个循环；94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35个循环；72°C10min，1个循环。以HpNCTC11637DNA为阳性对照，去离子水做阴性对照。

1.4 PCR产物的SSCP分析 PCR产物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C变性10min,加3μl电泳加样缓冲液（95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯腈蓝）混匀，于7.5%聚丙烯酰胺胶室温电泳300V，3.5min，以0.19%硝酸银染色30min，经显色液（1.5%NaOH,0.5%甲醛，0.0085%硼氰化钠）显色后观察结果，比较不同Hp菌株两条单链DNA片段的迁移情况。