PCR-SSCP

 

一.  样品的制备

1. 设计引物。用Oliga6.0对目的基因进行分析，设定引物，引物长度18-21个碱基，扩增片段以200-300bp最为合适。

2. PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。

3. PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ulSSCP上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2或3不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加3ul的PCR产物，缓冲液加到8ul变性效果更好。

4. PCR产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR仪上95变性5-10分钟，立即取出PCR产物连同架子一同置于冰上静置5min，以免变性的产物复性。

~undefined注：3和4步可以在制SSCP胶第四步后，等胶凝的过程中进行。

二. 制胶

1.  装板。在所要进行实验的每一副玻璃板（事先洗静、风干）的两边及底部装上垫片，尽量使底边及侧边紧密接触，夹子固定好，用0.8-1%的琼脂糖封边，确保接头处都封上以免漏胶。

2.  配胶。根据不同长度的PCR片段配置适合浓度的胶。最适合的胶浓度是经过多次的摸条件得来的，根据经验，不同长度的片段可能适合的胶浓度建议如附录1。

3. 灌胶。配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起，轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差0.5cm时插上梳子，要保证梳子齿和液面接触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。

4. 静置。灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度（100以下）静置水平桌面上30min左右使之充分聚合。

~undefined注：此时可以进行PCR样品变性，即第一部分的3、4步。

三.  上样

1. 安板。PAGE聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的一面朝里，安板时首先使板的底边一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。

2. 预电泳。从底槽把一些电泳液1×TBE吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边1cm以上，并确保上槽不漏液。打开电源，大槽电压调到140-150V，小槽110-120V，预电泳10min左右。

3. 点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。

4. 电泳。大槽电压140-150V，小槽110-120V，恒温电泳10个小时以上。

四. 染色

1. 固定。把胶卸下，做好起始记号，放入70%乙醇中在摇床上固定15min。固定好后乙醇回收（可以重复使用5次左右），蒸馏水洗两遍，每遍3min左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适当增加时间。

2. 染色。染色液（200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml）染色30min，同时染两块胶要适当增加时间，需40min左右。倒掉染色液，洗3遍，每遍3min，同时染两块胶要适当增加时间。

3. 显色。显色液（200ml显色也包含1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul）至清晰。倒掉显色液，加蒸馏洗脱3次停显。

附录

1. 不同长度的片段可能适合的胶浓度建议如下：

180-220bp左右            14%

250-280bp左右            13%

300-320bp左右            12%

360bp左右                10%

400bp以上                8%