病毒感染的实验室诊断

互联网2013-09-05

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佚名

病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。临床医师根据流行病学资料，疾病的症状与体征综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的标本送检。

一、检材的采集与送检

病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、咯痰、粪便、脑脊液、疱疹内容物、活检组织或尸检组织等。

供分离病毒、检出核酸及抗原的标本的，要求：

(一)尽早采取在发病初期(急性期)采取，较易检出病毒，越迟阳性率越低。

(二)部位适宜由感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液或咯痰；肠道感染采取粪便；脑内感染采取脑脊液；皮肤感染采取病灶组织；有病毒血症时采取血液。

(三)冷藏速送病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得检材应尽快送检。若距离实验室较远，应将检材放入装有冰块或干冰的空器内送检。病变组织则应保存于50%的甘油缓冲盐水中。污染检材，如鼻咽分泌液、粪便等应加入青霉素、链霉素或庆大毒素等，以免杂菌污染细胞或鸡胚，而影响病毒分离。

检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后2～3周采取。血清标本放4℃-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。无菌性脑炎患者也可取脑脊液检测特异性lgM。

表80-1 病毒检材采集与检验结果的关系

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 采取标本的时期 </td> <td> 检查病毒及其成分 </td> <td> 测定抗体 </td> </tr> <tr> <td> 潜伏期及前驱期 刚发病或急性期 恢复期及康复期 </td> <td> 较难查见 最多查见 很难查见 </td> <td> 未增多 未增多或增多不明显 明显增多(常超过4倍) </td> </tr> </tbody> </table> </center>

表80-2 供病毒分离的检材

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 临床表现 </td> <td>常见病毒</td> <td>帮助诊断有用的检材</td> </tr> <tr> <td> 呼吸道感染 </td> <td> 腺病毒 巨细胞病毒 流感病毒 副流感病毒 呼肠孤病毒 合胞病毒 </td> <td> 咽试、肛拭 咽试或含漱液、尿液 咽拭或含漱液 咽拭含漱液 咽拭、粪便或肛拭 咽拭或含漱液、鼻咽洗液 </td> </tr> <tr> <td>出疹疾病</td> <td> 柯萨奇病毒 巨细胞病毒 埃可病毒 EB病毒 单纯疱疹病毒 麻疹病毒 风疹病毒 水痘带状疱疹病毒 </td> <td> 粪便或肛拭、咽拭 咽拭或含漱液、尿液 粪便或肛拭、咽拭 咽拭或含漱液 病灶棉拭或吸取液、咽拭 咽拭或含漱液、尿液 咽洗液、鼻咽拭 病灶棉拭或吸取液、咽拭 </td> </tr> <tr> <td>脑炎</td> <td> 虫媒病毒 单纯疱疹病毒 麻疹病毒 脊髓灰质炎病毒 </td> <td> 血液、脑脊液 脑活检、脑脊液、疱疹棉拭或吸取液 脑脊液、咽拭或含漱液、尿液 粪便或肛拭、咽拭、脑脊液 </td> </tr> <tr> <td>无菌性脑膜炎</td> <td> 柯萨奇病毒 埃可病毒 腮腺炎病毒 </td> <td> 脑脊髓液、粪便或肛拭、咽拭 脑脊液、粪便或肛拭、咽拭 脑脊髓液、口颊粘膜棉拭 </td> </tr> <tr> <td>失天或新生儿感染</td> <td> 巨细胞病毒 风疹病毒 单纯疱疹病毒 </td> <td> 尿液、咽拭或含漱液 咽拭或含漱液、尿液 病灶棉拭或吸取液、回拭 </td> </tr> <tr> <td>眼部感染</td> <td> 腺病毒 单纯疱疹病毒 </td> <td> 结膜棉拭、咽拭、肛拭 结膜棉拭、病灶棉拭或吸取液、咽拭 </td> </tr> <tr> <td> 其它感染 巨细胞包涵体疾病 单核细胞增多综合征 心包炎、心肌炎 </td> <td> 巨细胞病毒 巨细胞病毒 EB病毒 柯萨奇B病毒 埃可病毒 </td> <td> 尿液、咽拭 尿液、咽拭 咽拭或洗液 心包液、粪便、咽拭 心包液、粪便、咽拭 </td> </tr> </tbody> </table> </center>

二、病毒的分离与鉴定

(一)病毒的分离

病毒分离的一般程序见表80-3。

表80-3 病毒分离的一般程序

细胞系名称

来源

二倍体细胞系

HDCS

MRC-9

WI-38

传代细胞系

Hela

Hep-2

Vero

BHK

人胚肺细胞

人宫颈癌细胞

人上皮细胞

猴肾细胞

地鼠肾细胞

<center> 淋巴细胞培养 (Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T细胞生长因子(IL-2)后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒(HIV、HTLV)提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。 2.动物试验这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉，例如嗜神经病毒(脑炎病毒)接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种乳鼠(一周龄)腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。 3.鸡胚培养用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内，如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养；但很多病毒在鸡胚中不生长。 (二)分离病毒的鉴定 1.病毒在细胞内增殖的指征 (1)细胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断(表80-4)。免疫荧光(IF)法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。 表80-4 病毒在细胞内增殖的指征 <center> <table> <tbody> <tr> <td> 病毒 </td> <td> 增殖指征 </td> </tr> <tr> <td> CPE病毒 小RNA病毒 单纯疱疹病毒 腺病毒 副粘病毒 HIV 非CPE病毒 正粘病毒 副粘病毒 风疹病毒 鼻病毒 </td> <td> 细胞园缩、单层破坏 细胞肿大变园 细胞变园堆积成葡萄状 多核巨细胞(合胞体) 红细胞吸附现象 干扰并阻止其他病毒(如ECHO病毒)的细胞致病作用 </td> </tr> </tbody> </table> </center> (2)红细胞吸附现象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-48小时，以细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。 (3)干扰现象 (Interference phenomenon) 一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒(如风疹病毒)但能干扰以后进入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。 2.病毒感染性的定量测定 空斑形成单位 (Plaque-forming unit ,PFU) 测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位(PFU)来表示。 (2)50%致死量(LD50)或50%组织细胞感染量(TCID50)的测定本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。 3.病毒形态与结构的观察病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构、序列同源性比较加以鉴定。 4.血清学鉴定用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科属；中和试验或血凝捣蛋制试验可鉴定病毒种、型及亚型。从病人检材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用病人急性期与恢复期双份血清作血清学试验，血清抗体滴度有≥4倍以上增高，才有意义。 三、病毒核酸及抗原的直接检出 (一)直接检出病毒核酸 1.核酸杂交(Nucleic acid hybridization) -临床病毒学中报速诊断方法通常是检测标本中的病毒抗原，然而核酸分子杂交具有高度敏感性和特异性，斑点杂交 (Dot hybridization) 广泛用于检测呼吸道标本，尿标本中的病毒核酸。标本滴加到硝酸纤维素膜上，病毒DNA结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂并，两条单股核酸按硷基到补原则结合成双股，经放射自显影，阳性结果出现斑点状杂交信号。含轮状病毒的粪便标本经热变性处理，点到膜上，使用轮状病毒体外转录的放射标记探针做斑点杂交，敏感性高于ELISA。肠道病毒也可用互补的DNA探针做斑点杂交。 目前核酸分子杂交不但用来检测急性病人标本中的病毒DNA，也用于检测不易分离培养的慢性感染、潜伏感染、整合感染病人标本中的病毒DNA。 2.多聚酶链反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 一种体外基因扩增法。先将待检标本DNA热变性为单股DNA做为模板，加一对人工合成的与模板DNA两端各20个硷基互补的引物，在耐热DNA多聚酶作用下，使四种脱氧核苷按模板3�端引物向5�端延伸DNA链，经20～40个循环，可使1个拷贝的核酸扩增至106以上，经琼脂糖电泳，可见到溴化乙锭染色的核酸条带，扩增片段的大小取决于两引物的间距。此法较核酸杂交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、疱疹病毒感染诊断，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本，有较大应用前景。 (二)直接检测病毒抗原 1.免疫荧光(IF)技术如前所述IF可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用检测临床标本中病毒抗原，具有快速、特异的优点。直接免疫荧光技术是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原；间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异性抗体结合，从而间接识别抗原。可取咽喉脱落细胞，检测呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或脑活检标本，检测单纯疱疹病毒抗原；取尿沉渣检测巨细胞病毒抗原等。近年来使用单克隆抗体大大提高了检测的灵敏度和准确性。 2.免疫酶法(IEA) 原理与应用范围同免疫荧光技术，IEA是用酶(通常是过氧化物酶)取代荧光素标记抗体，酶催化底物形成有色产物，在普通光学显微镜下清晰可见，不需荧光显微镜，便于推广使用。 3.放射免疫测定法(RIA) 有竞争RIA和因相RNA二种方法。竞急RIA是同位素标记的已知抗原与标本中未标记的待检抗原竞争性结合特异性抗体的试验，将形成的复合物分离出来，用放射免疫检测仪测定放射活性，同时与系列稀释的标准抗原测定结果进行比较，确定出待检抗原的浓度。因相RIA是用特异性抗体包被因相以捕获标本中的抗原，然后加入放射性标记的特异性抗体与抗原结合，测定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于测定粪便中甲肝病毒、轮状病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。 4.酶联免疫吸附试验(ELISA) 先将特异性抗体包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉标本中相应抗原，然后加入酶标特异性抗体，相应抗原被夹在抗体之间，当加入酶的底物后显色，显色程度直接反映了标本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接触放射性物质，已被多数实验室采用。 此外，对难以分离培养，形态特殊且病毒数量较多的标本，可用电镜或免疫电镜法直接观察，是一种快速诊断与鉴定病毒的方法，如轮状病毒、乙肝病毒。 四、特异性抗体的检测特异性抗体的检测 病毒感染后通常诱发针对病毒一种或多种抗原免疫应答，特异性抗体效价升高或lgM抗体出现有辅助临床诊断的价值。 (一)补体结合试验(CF) CF分二个阶段：1.抗原与抗体(一个为已知，一个为待检)混合，加入定量补体，若抗原与抗体相对应，则补体被消耗；2.在上述混合物中加入溶血素致敏的绵羊红细胞，若补本已与抗原抗体复合物完全结合，没有剩补体存在，那么绵羊红细胞不会溶血，结果为阳性，说明待检标本中有特异性存在，出现阳性结果时血清标本最高稀释度为抗体的效价。反之为阴性结果。由于补体结合抗体产生早，消失快，适于诊断病毒近期感染。(表80-5)。 <center> <table> <tbody> <tr> <td> 取血时期 </td> <td> 血清稀释倍数及试验结果 </td> <td> 抗体效价 </td> </tr> <tr> <td>1：2</td> <td>1：4</td> <td>1：8</td> <td>1：16</td> <td>1：32</td> <td>1：64</td> <td>1：128</td> </tr> <tr> <td> 发病2～3内血清 发病2～3周后血清 </td> <td> + + </td> <td> + + </td> <td> + + </td> <td> - + </td> <td> - + </td> <td> - - </td> <td> - - </td> <td> 1：8 1：3undefined </td> </tr> </tbody> </table> </center> ~undefined此例的抗体效价升高4倍，有诊断意义。 (二)中和试验(NT) 在活体或活细胞内测定病毒被特异性抗体中和、而失去致病力的试验。试验时：①须先测出病毒的半数致死量(LD50)或半数感染量(ID50)；②随即取活病毒与被试血清按不同比例混合，放置1～2小时让其充分中和；③将病毒与血清混合液注入各组动物、鸡胚或组织细胞培养管内培养；④根据动物、鸡胚死亡数或细胞病变的管数，计算出百分比(%)，然后再计算这些试验对象中的半数免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒)，就是该血清的中和抗体效价(称为50%终点的中和效价)。诊断病毒性疾病时，须取病人双份血清同时做对比试验，病后血清的中和抗体效价也必须超过病初血清4倍以上，才能确诊(表23-6)。用此法鉴定病毒时，须将病毒分别与免疫血清及血清正常血清(对照)混合做对比试验，免疫血清比正常血清多中和50～100倍剂量的病毒，才能断定是该病毒。、 表80-6 病人双份血清的病毒中和试验结果(组织细胞培养的中和试验) <center> <table> <tbody> <tr> <td> 试验病毒(用100个TCLD50)① </td> <td> 病人血清(取血时期) </td> <td> 活病毒+稀释血清对细胞致病② </td> <td> 50%终点血清中和抗体效价 ③ (血清稀释倍数) </td> </tr> <tr> <td> 1：5 </td> <td> 1：10 </td> <td> 1：20 </td> <td> 1：40 </td> <td> 1：80 </td> <td> 1：160 </td> </tr> <tr> <td> 甲病毒 </td> <td> 病初(2日) </td> <td> 0000 </td> <td> 00++ </td> <td> ++++ </td> <td> ++++ </td> <td> ++++ </td> <td> ++++ </td> <td> 10(1：10) </td> </tr> <tr> <td> 病后(20日) </td> <td> 0000 </td> <td> 0000 </td> <td> 0000 </td> <td> 0000 </td> <td> 00++ </td> <td> ++++ </td> <td> 80(1：80 </td> </tr> </tbody> </table> </center> 说明： ①TCID50=组织培养半数感染剂量。 ②每种稀释度接种4支组织细胞培养管；0=未出现细胞致病作用；+=出现细胞致病作用。 ③此例的病后血清中和抗体效价比病初血清增高8倍，有诊断意义。 病毒中和抗体的特异性高，持续时间久，以往受显性或隐性感染后，血中可长期存在中和抗体，所以适用于流行病学调查或人群免疫水平研究，但因试验方法繁杂，耗用动物、鸡胚或细胞培养较多，故一般不作常规使用。 (三)血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test,HIT)某些病毒(流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等)能凝集红细胞，而抗体与这些病毒结合后却能阻止它们的凝集，若双份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于诊断这类病毒感染。本法简便、快速、经济、特异性高，常用于流行病学调查等。 (四)lgM捕捉ELISA 特异性lgM出现于病毒感染的早期或病毒感染的活动期，因此可从急性期病人单份血清中检出特异性lgM，这是病毒感染实验室早期诊断的可靠方法。实验中先用u链血清包被微培板孔，用以捕捉血清标本中的lgM类抗体，再加入特异性病毒抗原及酶标抗体以证实特异性lgM的存在。现已广泛用于病毒病的早期诊断。在先天性感染中，lgM检测有特殊意义，因lgM不能通过胎盘，新生儿血清中发现抗病毒lgM提示为宫内感染。 <div> <div> <div> <div> </div> </div> </div> </div> </center>