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携带多个目的基因的重组腺病毒的制备

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1 、目的基因的获取:

   1 )特定细胞表达的目的基因:提取 RNA 后进行反转录, PCR 扩增;

2 )载体中含有的目的基因:酶切或 PCR 获取;

3 )融合蛋白基因:根据需求,进行 PCR 合成目的基因;

2 、穿梭质粒的构建:

1 )携带目的基因的穿梭质粒的构建:通过酶切、连接的方式得到,一般采用的是 pShuttle-cmv 载体;

2 )携带多个目的基因的穿梭质粒的构建:如同时表达两个目的基因,可通过 IRES 将两个目的基因相连;

3 )携带干涉序列 shRNA 的穿梭质粒:首先将 H1 启动子构建到 pShuttle 质粒上,然后将目的基因克隆到 H1 启动子下游;

3 、重组腺病毒质粒构建:

携带目的基因的穿梭质粒线性化后与 Adeasy-1 共转 BJ5183 感受态细胞(电转),筛选得到重组腺病毒质粒,并经 PacI 酶切鉴定:可见目的质粒出现两条条带,分别为 3.0kb 4.5kb >23Kb 两条条带。 将得到的重组腺病毒质粒转染 DH5 a 感受态细胞,以便于保存。

4 、重组腺病毒的制备:

PacI 酶切线性化的高纯度高浓度重组腺病毒质粒,以脂质体介导的方式转染 293 细胞, 7 10 天出现噬斑,待完全病变后,收集细胞和上清,于 -70 保存。

5 、重组腺病毒的鉴定

在基因水平,提取腺病毒基因组 DNA ,采用目的基因的引物, PCR 扩增病毒基因组 DNA ;并采用相应的引物,检测是否含有复制型腺病毒。

在蛋白水平,分泌蛋白,采用 ELISA 检测目的基因的表达;膜蛋白采用流式方法进行检测;其他蛋白采用 Western-blot 方法进行检测。

6 、病毒扩增及纯化:

根据实验的需要扩增重组腺病毒(细胞实验 20 40 皿;动物实验 60 80 皿),并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化,纯化得到的病毒用 10 %甘油保存。

7 、病毒滴度测定:

紫外分光光度法检测病毒的 OD260 280 值:根据 OD260nm 可推算病毒的颗粒滴度; OD260nm/OD280nm 代表病毒的纯度。

同时,采用快速 CPE TCID50 测定病毒的感染滴度。

 

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