携带多个目的基因的重组腺病毒的制备

1 、目的基因的获取：

   （ 1 ）特定细胞表达的目的基因：提取 RNA 后进行反转录， PCR 扩增；

（ 2 ）载体中含有的目的基因：酶切或 PCR 获取；

（ 3 ）融合蛋白基因：根据需求，进行 PCR 合成目的基因；

2 、穿梭质粒的构建：

（ 1 ）携带目的基因的穿梭质粒的构建：通过酶切、连接的方式得到，一般采用的是 pShuttle-cmv 载体；

（ 2 ）携带多个目的基因的穿梭质粒的构建：如同时表达两个目的基因，可通过 IRES 将两个目的基因相连；

（ 3 ）携带干涉序列 shRNA 的穿梭质粒：首先将 H1 启动子构建到 pShuttle 质粒上，然后将目的基因克隆到 H1 启动子下游；

3 、重组腺病毒质粒构建：

携带目的基因的穿梭质粒线性化后与 Adeasy-1 共转 BJ5183 感受态细胞（电转），筛选得到重组腺病毒质粒，并经 PacI 酶切鉴定：可见目的质粒出现两条条带，分别为 3.0kb 或 4.5kb 和 >23Kb 两条条带。 将得到的重组腺病毒质粒转染 DH5 a 感受态细胞，以便于保存。

4 、重组腺病毒的制备：

将 PacI 酶切线性化的高纯度高浓度重组腺病毒质粒，以脂质体介导的方式转染 293 细胞， 7 ～ 10 天出现噬斑，待完全病变后，收集细胞和上清，于 -70 ℃ 保存。

5 、重组腺病毒的鉴定

在基因水平，提取腺病毒基因组 DNA ，采用目的基因的引物， PCR 扩增病毒基因组 DNA ；并采用相应的引物，检测是否含有复制型腺病毒。

在蛋白水平，分泌蛋白，采用 ELISA 检测目的基因的表达；膜蛋白采用流式方法进行检测；其他蛋白采用 Western-blot 方法进行检测。

6 、病毒扩增及纯化：

根据实验的需要扩增重组腺病毒（细胞实验 20 ～ 40 皿；动物实验 60 ～ 80 皿），并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化，纯化得到的病毒用 10 ％甘油保存。

7 、病毒滴度测定：

紫外分光光度法检测病毒的 OD260 和 280 值：根据 OD260nm 可推算病毒的颗粒滴度； OD260nm/OD280nm 代表病毒的纯度。

同时，采用快速 CPE 和 TCID50 测定病毒的感染滴度。