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酵母遗传学方法2:蛋白质的抽提

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酵母蛋白质的抽提

 

此法抽提的酵母蛋白适用于 SDS 凝胶电泳和 Western 印迹分析。

1. OD600 2 的细胞培养物中抽提酵母蛋白质。培养物的一种简单制备方法是将细胞接种到 5ml YPD 中,过夜培养后获得指数培养物( OD600 0.5 2.0 )。

2. 在水浴上把 OD600 2 的细胞培养物转到含有 2ml 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/L 叠氮化钠溶液的 13mm 离心管中,用吊篮式医用离心机离心沉淀细胞。

3. 25 号针头吸出上清液,再用 30 μ l ESB 缓冲液悬浮细胞。

4. 快速转入微型离心管,在 100 ℃下保温 3 分钟,使蛋白酶失活之后,样品存放于- 20 ℃。

5. 加入 0.1g 0.2mm 的玻珠,或装入玻珠直至液体刚好浸没,剧烈振荡混合 2 分钟。

6. 加入 70 μ l ESB 缓冲液,稍加振荡,置 100 ℃保温 1 分钟。

ESB 缓冲液(可在 4 ℃贮存数天):

2 SDS

80 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)

10% 甘油

1.5 二硫基苏糖醇( DTT

0.1mg/ml 溴酚蓝

7 .取 5 20 μ l 抽提液上样进行 SDS 凝胶电泳。

 

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