酵母遗传学方法2：蛋白质的抽提

 

酵母蛋白质的抽提

 

此法抽提的酵母蛋白适用于 SDS 凝胶电泳和 Western 印迹分析。

1． 从 OD₆₀₀ ＝ 2 的细胞培养物中抽提酵母蛋白质。培养物的一种简单制备方法是将细胞接种到 5ml YPD 中，过夜培养后获得指数培养物（ OD₆₀₀ ＝ 0.5 ～ 2.0 ）。

2． 在水浴上把 OD₆₀₀ ＝ 2 的细胞培养物转到含有 2ml 的 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 、 10mmol/L 叠氮化钠溶液的 13mm 离心管中，用吊篮式医用离心机离心沉淀细胞。

3． 用 25 号针头吸出上清液，再用 30 μ l ESB 缓冲液悬浮细胞。

4． 快速转入微型离心管，在 100 ℃下保温 3 分钟，使蛋白酶失活之后，样品存放于－ 20 ℃。

5． 加入 0.1g 的 0.2mm 的玻珠，或装入玻珠直至液体刚好浸没，剧烈振荡混合 2 分钟。

6． 加入 70 μ l ESB 缓冲液，稍加振荡，置 100 ℃保温 1 分钟。

ESB 缓冲液（可在 4 ℃贮存数天）：

2 ％ SDS

80 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)

10% 甘油

1.5 ％ 二硫基苏糖醇（ DTT ）

0.1mg/ml 溴酚蓝

7 ．取 5 ～ 20 μ l 抽提液上样进行 SDS 凝胶电泳。