G418筛选稳定表达细胞系实验步骤

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1.G418的配制 ：

方案一： 300mgG418加入3ml PBS 溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um

过滤，-20℃保存。

方案二：(1)配制1M HEPES：23.8g HEPES(缓冲能力更强)粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH(加量较多)调节pH至7.3，过滤除菌(较难过滤)，4℃保存，终浓度为1mol/L。

(2)5g G418溶于10ml 1M HEPES(pH7.3)，终浓度为500mg/ml，-20℃保存。

注：实验中采用方案二时效果较好。

2.制备筛选培养基： 用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml

24孔板，每孔1ml培养基(含有G418的完全培养基)，每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。

<center> <img alt="G418筛选稳定表达细胞系实验步骤" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591195.jpg" /></center>

3.细胞培养 ： 将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板(20000/孔)，12h换液，加筛选培养基培养。

4.确定G418最佳筛选浓度： 将培养孔中培养基吸除，PBS 洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。

注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。

5.铺6孔板(20万/孔)，第二天转染 ，6小时后换新鲜正常培养基。转染 24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。

注意：细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果(G418很难发挥作用)。

6.在换液一两次后(换液后培养过夜 )，细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22um过滤，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用。

7.培养6天左右细胞大量死亡时 ，可以换用适应性培养基，即6中所配制。或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。

8.培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。

9.筛选约14天后可见有抗性克隆出现。

10.挑单克隆： 高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。

●套环法：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的培养孔中培养。

●刮除法：刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。

11.单克隆鉴定： 细胞大量扩增后，①提取总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达 ②western检测目的基因。

注意：转染时压系时细胞不能铺的太满，不然当细胞连接紧密后，压系时不具G418抗性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。