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氨基酸纸层析

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一、原理:氨基酸混合液经纸上层析,由于不同的氨基酸有不同的分配系数,移动速率不同,从而达到分离。经显色后,与标准氨基酸图谱 比较或与氨基酸的标准Rf值比较,可辨别各种氨基酸。
二、材料与试剂
1、酸向展开剂:正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2,量取正丁醇150ml,88%甲酸30ml,蒸馏水20ml,置入分液漏斗中充分振荡。此液需新配制。
2、12%氨水:量取60ml浓氨水,加入70ml蒸馏水稀释。
3、碱向展开剂:正丁醇:12%氨水=13:3,量取130ml正丁醇,30ml12%氨水,置于分液漏斗中充分振荡。
4、0.2%茚三酮显色液:称取0.2g茚三酮,溶于100ml丙酮中。
5、0.5%标准氨基酸溶液:称取各种氨基酸各0.5g,分别置于100ml容量瓶中,用10%异丙酮溶液溶解,定容至刻度。
6、微量注射器、层析缸、新华滤纸、喷雾器、氨基酸混合液(可任选2-3种)
表2-4 各种氨基酸的标准Rf值
氨基酸 标准Rf值 氨基酸 标准Rf值
第一相(酸向) 第二相(碱相) 第一相(酸向) 第二相(碱相)
天门冬氨酸
谷氨酸
赖氨酸
精氨酸
组氨酸
甘氨酸
羟丁氨酸
r-氨基丁酸
丙氨酸
酪氨酸
0.27
0.35
0.12
0.15
0.11
0.30
0.37
0.46
0.47
0.25
0.01
0.01
0.03
0.05
0.10
0.06
0.10
0.08
0.14
0.23
蛋氨酸
颉氨酸
色氨酸
异亮氨酸
亮氨酸
苯丙氨酸
胱氨酸
丝氨酸
脯氨酸
0.64
0.67
0.64
0.77
0.79
0.73
0.08
0.28
0.48
0.31
0.32
0.48
0.52
0.57
0.58
0.02
0.06
0.16
三、操作
1、层析滤纸的准备:取两张19cm×23cm的新华滤纸一号,在右下角距二底边各2cm交点处用铅笔画一原点,同时画出二边的原线。
2、点样:将10ul样品液点于一张滤纸原点上,用微量注射器分多次点完。点一次后,吹干再点第二次。点的直径应小于0.5cm。
3、展开:将点样后的两张滤纸在相同的操作条件下用上行法进行双向展开。
(1)第一向(酸相)展开:以滤纸19cm长的一边为高,用线缝成圆筒形(注意纸的两边不相碰),放在盛有酸相展开剂的层析缸内饱和1h。然后将点样端放入展开剂中,待溶液前沿上升至离顶端1cm左右时取出,吹干至无正丁醇气味为止。
(2)第二向(碱相)展开:把滤纸转900,以23cm长的一边为高,用线缝成圆筒形(注意纸的两边不相碰),放在盛有碱相展开剂的层析缸内饱和1h。然后将点样端放入展开剂中,待溶液前沿上升至离顶端1cm左右时取出,吹干。然后以同样条件,再在碱相展开剂中展开一次,取出吹干。
4、显色:展开结束后,滤纸用0.2%茚三酮溶液喷雾显色,65℃烘干。
四、定性鉴定:用样品的层析图谱与标准氨基酸图谱的层析图谱相比较,根据Rf值的大小,确定样品中氨基酸的种类。
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