原理
纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。分配层析法是利用物质在两种不同混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的。通常用α表示分配系数。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。
层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维素对水有较强的亲和力（纸上有很多-OH 基与水以氢键相连），吸附很多水分子，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这一部分水扩散作用降低形成静止相；而有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流动，便形成流动相。层析时，将滤纸一端浸入层析溶剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量也就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在静止相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。
移动速度一般用移动速率表示Rf 表示：
各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。
Rf值决定于很多的因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的分配系数是由以下因素决定的：
（1）物质极性的大小。水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸分配在水相中，Rf值较小，而含非极性（如-CH3 ）较多的物质其分子的极性降低，Rf值增大。
（2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。
（3）溶剂的纯度、pH值和含水量。pH值和含水量的改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变，Rf值也随之改变。
（4）层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，测Rf值的因素必须严格控制。
层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维素对水有较强的亲和力（纸上有很多-OH 基与水以氢键相连），吸附很多水分子，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这一部分水扩散作用降低形成静止相；而有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流动，便形成流动相。层析时，将滤纸一端浸入层析溶剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量也就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在静止相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。
移动速度一般用移动速率表示Rf 表示：
各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。
Rf值决定于很多的因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的分配系数是由以下因素决定的：
（1）物质极性的大小。水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸分配在水相中，Rf值较小，而含非极性（如-CH3 ）较多的物质其分子的极性降低，Rf值增大。
（2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。
（3）溶剂的纯度、pH值和含水量。pH值和含水量的改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变，Rf值也随之改变。
（4）层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，测Rf值的因素必须严格控制。
材料与仪器
绿豆芽
天冬氨酸 赖氨酸 苏氨酸 丙氨酸 甲硫氨酸 亮氨酸
恒温水浴 烘箱 研钵 三角瓶 蒸发皿 分液漏斗 量筒 微量吸管 电热吹风机 层析缸 层析滤纸 小型喷雾器 剪刀 刀片 铅笔 尺子 玻棒 凡士林 点样瓶
天冬氨酸 赖氨酸 苏氨酸 丙氨酸 甲硫氨酸 亮氨酸
恒温水浴 烘箱 研钵 三角瓶 蒸发皿 分液漏斗 量筒 微量吸管 电热吹风机 层析缸 层析滤纸 小型喷雾器 剪刀 刀片 铅笔 尺子 玻棒 凡士林 点样瓶
步骤
一、实验材料、仪器和试剂
1、实验材料：在25℃温箱中萌发2-3天的绿豆芽。
2、仪器：（1）恒温水浴一台；（2）烘箱一个；（3）研钵一个；（4）三角瓶一个 ；（5）蒸发皿一个；（6）50毫升分液漏斗一个；（7）量筒三个；（8） 微量吸管（或标有刻度的毛细管）；（9）电热吹风机一个；（10） 层析缸及培养皿；（11）层析滤纸；（12）小型喷雾器一个；（13）剪刀、刀片、铅笔、尺子、玻棒、凡士林、点样瓶。
3、试剂：
（1）氨基酸标准溶液：浓度为0.01M，溶于10%异丙醇中。
第一组：天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。
第二组：鸟氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸。
第三组：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸。
第四组：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺。
第五组：胱氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、瓜氨酸、天门冬酰胺。
（2）溶液系统：
第一向：正丁醇：甲酸：水：（15：3：2，体积），摇匀静止备用。
第二向：苯酚：水（80：20，重量）。配制方法：在分液漏斗中先计量加入少量无离子水，再加入一定量的新蒸馏的酚。根据酚量补足应加入的全部无离子水，这样可避免因酚的冷凝而造成的溶解困难。充分摇匀后静止备用。
（3）无离子水：用于实验中各种试剂配制。
（4）10%异丙醇：用于配制氨基酸标准液。
（5）80%乙醇：取分析乙醇以无离子水稀释。
（6）0.25%的水合茚三酮溶液。
（7）活性炭。
（8）石英砂。
二、操作步骤：
1、氨基酸的提取：
取新鲜的绿豆芽下胚轴2克，加80%乙醇10毫升，加少量石英砂，在研钵研成匀浆，移入三角瓶，用少量80%乙醇淋洗研钵，一并移入三角瓶，加0.8克活性炭，置沸水浴中加热至沸1分钟，取下冷却，用滤纸过滤，用少量80%乙醇冲洗滤渣。滤液收集在蒸发皿中置50-60℃水浴上蒸干。用1毫升10%异丙醇溶解，收集样液，准备点样。
2、滤纸的准备：
单向层析滤纸：取28×28厘米层析滤纸一张，在对应的两边距每边2厘米处，用铅笔和直尺各划一条平行于纸边的直线，其中一条为溶剂前沿到达标志，另一条为点样线。在点样线上每隔2厘米划一与点样线垂直的短线，标出五组标准氨基酸和样品的点样位置
双向层析滤纸：取28×28厘米层析滤纸二张，在距每边2厘米处各划一条平行于纸边的直线，以“井”字格下边缘直线左端交点为点样原点，原点右手为第一向，另一垂直方向为第二向。用一张作标准氨基酸图谱，另一张作样品图谱。
3、点样：
点样时选用微量吸管或标有刻度的毛细管（每小格1微升），分别在每个点样处精确点样4微升。必须在每一滴样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可在有加热装置的点样台上进行，或用吹风机吹干，样点的直径以2-3毫米为宜，点样时温度不能过高，否则会破毁氨基酸。将点好样品的单向和双向层析滤纸均卷成筒形，在上、中、下三处系三道线，但滤纸两边缘不能接触。为了消除盐酸的干扰，避免拖尾现象，可将层析滤纸放入盛有浓氨水的层析缸中熏10分钟，取出后在45℃烘箱中将氨驱净，再行层析。
4、层析：
本试验采用上层析法。
（1）单向层析：取适当大小的层析缸一个，缸底放一培养皿，向培养皿内加入第一向溶剂，液层厚约1.5厘米，在培养皿上横放两根玻棒，取已点好的样品的单向层析滤纸以点样端朝下放在盛有层析溶剂的层析缸内的玻棒上，盖上盖子（滤纸切勿与溶剂接触）。平衡一小时，然后将滤纸放入层析溶剂中，注意样点不能进入溶剂，以免浸脱。将层析缸密封，这时溶剂沿纸上升，待溶剂前沿到达标志线时，立即取出，用吹风机吹干或45℃下烘干，然后显色。
（2）双向层析：按上述单向层析方法，将点好标准氨基酸的样品的双向层析滤纸分别用第一向溶剂进行上行层析，到达前沿标志线时，立即取出吹干溶剂，减去溶剂前沿以外的部分，然后将纸转90°角，以同样的方法用第二向溶剂进行上行层析，当溶剂前沿到达标志时立即取出吹干或45℃下烘干，进行显色。
5、显色：
用喷雾器将0.25% 的茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上，注意不要喷得过多。用吹风机吹干溶剂后，放在60-65℃烘箱中烘30分钟或用吹风机吹热风，即能显现各种氨基酸的色斑。为了消除铵离子的影响，可在展开后在滤纸上喷1%的氢氧化钾的无水乙醇溶液，在60℃下保持15分钟，以使全部氨完全挥发掉，再行显色。
1、实验材料：在25℃温箱中萌发2-3天的绿豆芽。
2、仪器：（1）恒温水浴一台；（2）烘箱一个；（3）研钵一个；（4）三角瓶一个 ；（5）蒸发皿一个；（6）50毫升分液漏斗一个；（7）量筒三个；（8） 微量吸管（或标有刻度的毛细管）；（9）电热吹风机一个；（10） 层析缸及培养皿；（11）层析滤纸；（12）小型喷雾器一个；（13）剪刀、刀片、铅笔、尺子、玻棒、凡士林、点样瓶。
3、试剂：
（1）氨基酸标准溶液：浓度为0.01M，溶于10%异丙醇中。
第一组：天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。
第二组：鸟氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸。
第三组：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸。
第四组：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺。
第五组：胱氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、瓜氨酸、天门冬酰胺。
（2）溶液系统：
第一向：正丁醇：甲酸：水：（15：3：2，体积），摇匀静止备用。
第二向：苯酚：水（80：20，重量）。配制方法：在分液漏斗中先计量加入少量无离子水，再加入一定量的新蒸馏的酚。根据酚量补足应加入的全部无离子水，这样可避免因酚的冷凝而造成的溶解困难。充分摇匀后静止备用。
（3）无离子水：用于实验中各种试剂配制。
（4）10%异丙醇：用于配制氨基酸标准液。
（5）80%乙醇：取分析乙醇以无离子水稀释。
（6）0.25%的水合茚三酮溶液。
（7）活性炭。
（8）石英砂。
二、操作步骤：
1、氨基酸的提取：
取新鲜的绿豆芽下胚轴2克，加80%乙醇10毫升，加少量石英砂，在研钵研成匀浆，移入三角瓶，用少量80%乙醇淋洗研钵，一并移入三角瓶，加0.8克活性炭，置沸水浴中加热至沸1分钟，取下冷却，用滤纸过滤，用少量80%乙醇冲洗滤渣。滤液收集在蒸发皿中置50-60℃水浴上蒸干。用1毫升10%异丙醇溶解，收集样液，准备点样。
2、滤纸的准备：
单向层析滤纸：取28×28厘米层析滤纸一张，在对应的两边距每边2厘米处，用铅笔和直尺各划一条平行于纸边的直线，其中一条为溶剂前沿到达标志，另一条为点样线。在点样线上每隔2厘米划一与点样线垂直的短线，标出五组标准氨基酸和样品的点样位置
双向层析滤纸：取28×28厘米层析滤纸二张，在距每边2厘米处各划一条平行于纸边的直线，以“井”字格下边缘直线左端交点为点样原点，原点右手为第一向，另一垂直方向为第二向。用一张作标准氨基酸图谱，另一张作样品图谱。
3、点样：
点样时选用微量吸管或标有刻度的毛细管（每小格1微升），分别在每个点样处精确点样4微升。必须在每一滴样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可在有加热装置的点样台上进行，或用吹风机吹干，样点的直径以2-3毫米为宜，点样时温度不能过高，否则会破毁氨基酸。将点好样品的单向和双向层析滤纸均卷成筒形，在上、中、下三处系三道线，但滤纸两边缘不能接触。为了消除盐酸的干扰，避免拖尾现象，可将层析滤纸放入盛有浓氨水的层析缸中熏10分钟，取出后在45℃烘箱中将氨驱净，再行层析。
4、层析：
本试验采用上层析法。
（1）单向层析：取适当大小的层析缸一个，缸底放一培养皿，向培养皿内加入第一向溶剂，液层厚约1.5厘米，在培养皿上横放两根玻棒，取已点好的样品的单向层析滤纸以点样端朝下放在盛有层析溶剂的层析缸内的玻棒上，盖上盖子（滤纸切勿与溶剂接触）。平衡一小时，然后将滤纸放入层析溶剂中，注意样点不能进入溶剂，以免浸脱。将层析缸密封，这时溶剂沿纸上升，待溶剂前沿到达标志线时，立即取出，用吹风机吹干或45℃下烘干，然后显色。
（2）双向层析：按上述单向层析方法，将点好标准氨基酸的样品的双向层析滤纸分别用第一向溶剂进行上行层析，到达前沿标志线时，立即取出吹干溶剂，减去溶剂前沿以外的部分，然后将纸转90°角，以同样的方法用第二向溶剂进行上行层析，当溶剂前沿到达标志时立即取出吹干或45℃下烘干，进行显色。
5、显色：
用喷雾器将0.25% 的茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上，注意不要喷得过多。用吹风机吹干溶剂后，放在60-65℃烘箱中烘30分钟或用吹风机吹热风，即能显现各种氨基酸的色斑。为了消除铵离子的影响，可在展开后在滤纸上喷1%的氢氧化钾的无水乙醇溶液，在60℃下保持15分钟，以使全部氨完全挥发掉，再行显色。
常见问题
单向层析：显色完毕后，用铅笔将各色谱的轮廓和中心点描绘出来，然后量出由原点至色谱中心点和溶剂前沿的距离，计算出各种已知和未知的色谱的Rf值进行比较和鉴定。各组已知氨基酸色谱顺序由指导教师供给。
双向层析：Rf值有两个数值组成，即要在第一向和第二向层析中各计算一次，根据Rf并借助各种氨基酸的特有颜色，分别与标准氨基酸对比，即可鉴定为何种氨基酸。
双向层析：Rf值有两个数值组成，即要在第一向和第二向层析中各计算一次，根据Rf并借助各种氨基酸的特有颜色，分别与标准氨基酸对比，即可鉴定为何种氨基酸。
来源：丁香实验
