合作专家 | 杨子怡硕士
药学 复旦大学
审核专家 | 于涛博士
生物化学分子生物 中国科学院大学
简介
凯氏定氮法是一种常用的化学分析方法，用于确定有机和无机物样品中的氮含量。它最初由丹麦化学家约翰·乔治·凯尔达尔（Johann Kjeldahl）于 1883 年发明并命名。该方法主要适用于测定蛋白质、肉类、饲料、土壤、肥料等样品中的氮含量。
原理
凯氏定氮法的原理是基于氨的定量反应，其中有机物样品中的氮通过消化和蒸馏步骤转化为氨气，并通过滴定进行量化测定。
由于氮在许多生物和环境样品中广泛存在，凯氏定氮法成为测定样品中氮含量的常用方法。往样品中加入浓硫酸和催化剂，充分混匀，然后加热消化分解，样品中碳和氢被氧化成二氧化碳和水，其中的有机氮转化为硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为氨基酸的含量。
用途
该方法在食品、农业、环境科学等领域广泛应用，用于确定样品中的蛋白质含量、评估肥料的氮含量、监测土壤中的氮素含量以及研究生物化学和环境过程中的氮循环。
材料与仪器
样品、浓硫酸、氢氧化钠
蒸馏装置（蒸馏瓶、冷凝器等）、捕集瓶
酸碱指示剂、滴定管、滴定管支架
滴定管夹具、硼酸溶液
步骤
1、准备工作：
确保实验室安全，并佩戴适当的防护设备，如实验室外套、手套和护目镜。
准备所需材料：样品、浓硫酸、氢氧化钠、酸碱指示剂、滴定管、滴定管支架、蒸馏装置、捕集瓶等。
2、样品消化：
将准确称量的样品放入消化瓶中。
加入适量的浓硫酸，注意避免过量（可适当加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解）。
加热消化瓶，使用适当的加热设备和条件进行消化。注意控制温度，避免溢出和飞溅。
3、蒸馏：
将消化产物转移到蒸馏瓶中，并加入适量的氢氧化钠溶液。
安装冷凝器和捕集瓶，确保密封良好。
加热蒸馏瓶，使产生的氨气通过冷凝器，并在捕集瓶中收集。
4、中和与滴定：
将捕集瓶中的氨气溶解在 10 ml 硼酸溶液酸性溶液中，可以加入一滴酸碱指示剂来辅助判断中和点。
使用已知浓度的酸溶液进行滴定，缓慢滴加，直到溶液颜色发生明显变化，表示中和完成。
记录滴定所使用的酸溶液体积，以计算样品中的氮含量。
5、计算结果：
根据滴定所使用的酸溶液的浓度和体积，以及样品的质量，计算样品中的氮含量。
计算样品中的氮含量可以使用以下公式：
氮含量（%）= （酸溶液浓度 × 酸溶液体积 × 氮原子的当量数）/ 样品质量
其中，
酸溶液浓度是指用于滴定的酸溶液的浓度，单位可以是摩尔/升或克/升，根据具体实验情况而定。
酸溶液体积是滴定时所使用的酸溶液的体积，单位可以是升或毫升，根据实验中所记录的值而定。
氮原子的当量数是指氮在化学反应中的当量数，对于凯氏定氮法，它的当量数为 1。
样品质量是指用于实验的样品的质量，单位可以是克或毫克，根据实验中所使用的质量而定。
注意事项
在进行凯氏定氨法实验时，以下是一些需要注意的事项，以避免出错或导致实验失败：
1. 安全注意：
凯氏定氨法使用浓硫酸等强酸，需要注意安全操作，佩戴适当的防护设备，如实验室外套、手套和护目镜。
酸性溶液和氨气具有刺激性和有毒性，保持实验室通风良好，并避免直接接触这些物质。
2. 样品消化：
控制消化过程中的温度和时间，避免过高的温度和过长的消化时间，以防止样品的分解或其他不必要的反应发生。
确保消化瓶的密封良好，避免消化过程中的气体泄漏。
3. 蒸馏：
确保蒸馏装置的密封性能良好，以避免氨气泄漏或外界空气进入。
为防止水中微量的氨气受热逸出，影响测定结果，所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。
注意控制蒸馏速率，过快的蒸馏速率可能导致氨气无法完全被捕集。
4. 中和与滴定：
使用合适的酸碱指示剂，确保滴定终点的准确判断。
（以下是一些常见的酸碱指示剂及其适用情况：
√ 酚酞指示剂：
颜色变化范围：pH 8.2~10.0
适用于强酸与弱碱的滴定，如硫酸与氨水滴定。
√ 紫蓝指示剂（布洛芬蓝）：
颜色变化范围：pH 4.6~6.0（红-蓝）
适用于弱酸与弱碱的滴定，如乙酸与氨水滴定。
√ 甲基橙指示剂：
颜色变化范围：pH 3.2~4.4（红-黄）
适用于强酸与强碱的滴定，如盐酸与氢氧化钠滴定。
√ 酸碱紫指示剂：
颜色变化范围：pH 0.0~1.6（红-紫）
适用于强酸与强碱的滴定，如硫酸与氢氧化钠滴定。
√ 溴酚蓝指示剂：
颜色变化范围：pH 3.0~4.6（黄-蓝）
适用于酸性溶液与中性溶液的滴定。）
缓慢滴加酸溶液进行滴定，特别是接近滴定终点时，需要谨慎操作，避免过量滴加。
5. 数据记录与计算：
保持准确的实验记录，包括酸溶液浓度、滴定体积等数据，以便后续计算和分析。
注意单位的一致性，确保在计算中使用相同的单位。
6. 仪器与试剂：
所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
确保使用的仪器和试剂的质量良好，并按照指定的存储条件进行保存。
校准仪器，如蒸馏装置和滴定管，以确保其准确性和可靠性。
常见问题
1. 消化不完全或溢出问题：
问题：样品在消化过程中没有完全消化或反应溢出。
解决办法：控制消化温度和时间，确保样品完全消化，避免过高温度和过长时间。同时，使用适当的消化容器和适量的消化试剂，以避免反应溢出。
2. 氨气收集问题：
问题：氨气无法完全收集或泄漏。
解决办法：确保蒸馏装置的密封良好，检查各个连接点是否紧固。使用合适的捕集瓶和冷凝器，控制蒸馏速率，避免氨气泄漏。
3. 滴定终点判断问题：
问题：难以确定滴定终点，特别是颜色变化不明显。
解决办法：选择合适的酸碱指示剂，根据样品性质和滴定条件，选择适合的指示剂。如果颜色变化不明显，可以采用逐滴加入的方法，慢慢观察颜色变化，以准确判断滴定终点。
4. 实验结果异常或不准确问题：
问题：实验结果与预期不符，或数据不准确。
解决办法：检查实验操作的准确性，如样品质量、试剂用量和浓度的准确性。确保仪器的准确性，如蒸馏装置的校准和滴定管的准确度。再次检查实验步骤是否正确执行，并参考实验指南或专业资源进行核对。
5. 安全问题：
问题：实验过程中发生安全问题或意外。
解决办法：始终遵循实验室安全规范和操作程序。佩戴适当的防护设备，保持实验室通风良好。在实验前评估潜在风险，并采取必要的预防措施。
来源：丁香实验
