胶体金免疫层析法检测蛋白A抗体实验方法与步骤

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摘 要： 目的 建立一种快速、简易的检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白A(CagA)抗体的胶体金免疫层析法(GICA)。 方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，将重组 的CagA抗原划线固定于硝酸纤维素膜上，制成免疫层析检测试条。 血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。 结果 用GICA与ELISA试剂盒对比检测了326份血清标本中抗CagA抗体，本方法的特异性为95.8%，敏感性为97.3%，两法符合率为96.6%。 结论 GICA检测血清中的抗CagA抗体特异性强、灵敏度高、简便快速，无需特殊仪器设备，有广泛应用价值。

关键词：螺杆菌，幽门;细胞毒素相关蛋白A/ 分析;胶体金;免疫 层析;抗体/ 分析

中国图书馆分类号 R 573

一、引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp) 与上消化道疾病的发生有十分密切的关系。 国外报道，人群中约有一半感染了Hp，其中约50%的Hp菌株表达细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated gene A protein, CagA)。 目前国内尚缺乏CagA阳性Hp感染的流行病学资料。 我们拟建立简单而快速检测抗Hp-CagA抗体的胶体金免疫 层析法(gold immunochr_omatography assay, GICA)。

二、材料和方法

1、材料 氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)：成都化学试剂厂产品：葡萄球菌A蛋白(SPA)：卫生部上海生物制品研究所 ;细胞毒素相关蛋白A(CagA)：基因工程产品，本所制备;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗CagA-IgG试剂盒：上海晶莹生物制品公司;血清标本：由第四军医大学中心血库及消化内科提供;Z 323 K低温高速离心机：德国;LGJ 0.5-Ⅱ冷冻干燥机：军事医学科学院实验仪器厂;点膜器：美国Bio-Dot公司。

2、 方法

(1)15 nm胶体金的制备 参照文献[4]进行。 其步骤为：去离子水 溶解氯金酸使其终浓度为0.2 g/ L，煮沸后每100 mL加入10 g/ L柠檬酸三钠水溶液4 mL，继续煮沸7min. 电镜观察胶体金的粒度。

(2) 免疫胶体金的制备 取颗粒直径为15 nm的胶体金100 mL，用0.1 mol/ L K2CO3调至pH 6.2，在搅拌状态下加入SPA(1 g/ L) 0.6 mL，继续搅拌10min;加入50 g/ L BSA 10 mL，继续搅拌5min. 4℃下3000 r/ min离心5min，弃沉淀，上清液以12 000 r/ min离心15min，小心移去上清液，沉淀即为制备的胶体金。 用20 mL悬浮液悬浮沉淀，以吸水纤维吸附后冷冻干燥4 h，4℃保存备用。

(3)免疫层析测试条的制备 测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。 吸水纤维部分附着有胶体金免疫复合物;在硝酸纤维素膜上用CagA(1.5 mg/ L)及人IgG(1 mg/ L)划线(1 mm宽)，分别作为检测线和对照线，晾干，用50 g/ L BSA封闭2 h，以0.01 mol/ L PBS洗涤3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5 cm×10 cm的试条，加干燥剂密封保存。

(4)抗Hp-CagA IgG的检测 以新鲜血清为佳。 试管中加入0.1 mL～0.2 mL血清，将测试条含有金标记物的一端插入血清内即可。 结果判定：以测试条硝酸纤维素膜上出现两条红色条带为抗Hp-CagA IgG阳性;仅出现一条红色条带(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性。 如果无红色条带出现则视为试剂失效。 结果确定时间：强阳性标本在5min内即可在检测线处见到红色胶体金颗粒聚集;弱阳性标本约需要10min确定结果。

三、结果

1、胶体金颗粒直径的电镜观察 用预先处理好的覆盖有Formvar膜的镍网侵入胶体金溶液中，取出放入空气中干燥，然后在透射电镜下观察，可见胶体金颗粒大小均匀一致，颗粒直径约为15 nm(图1)。

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图1 胶体金颗粒的透射电镜观察结果。

2、试剂盒的特异性及敏感度 采用本实验所建立的胶体金免疫层析法与ELISA试剂盒对比检测西京医院门诊及住院326例患者血清中的抗Hp-CagA IgG，结果见表1.

表1 GICA与ELISA检测结果比较

ELISA 合计

+ -

GICA + 178 　6 184

- 　5 137 142

合计 　 183 143 326

由表1可见，若以ELISA检测抗Hp-CagA抗体试剂盒作为参照标准，则GICA法的特异性为95.8%，敏感度为97.3%，总符合率为96.6%。

3、稳定性试验 GICA试剂盒于4℃下放置6 mo，每月检测抗Hp-CagA IgG阳性及阴性血清各50份，该试剂盒的各种性能指标均稳定。 将GICA试条于37℃温箱放置6 d，做热稳定性试验，与放置4℃的试条对照，结果无明显差别。

三、讨论

免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式。 Beggs et al[1]于1990年首次报道了斑点免疫层析试验(dot immunochromatographic assay, DICA)，用以检测孕妇尿液中的HCG进行早孕诊断，继而有采用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原[2]及抗HCV-IgG[3]的报道。 本文建立的胶体金免疫层析快速检测抗Hp-CagA抗体的方法集中了免疫与层析色谱的特点，使待测样品中的IgG与吸水纤维上的金标SPA不断结合，形成IgG-金标SPA复合物，再由层析作用，持续通过硝酸纤维素膜，与膜上固相CagA结合。 该方法具有以下特点：①敏感度高：由于在试验中所有样品均经过狭窄的硝酸纤维素膜，实际上是对被测的物质起到了浓缩的作用，从而使免疫层析比免疫渗滤法更为敏感，与ELISA检测的敏感度相近。 ②特异性强：本试剂盒采用高活性的重组CagA纯品作抗原，极大地提高了检测的特异性。 胶体金及免疫胶体金的性能，也是影响特异性的一个重要因素。 研究中我们结合有关文献[4-6]，经过不断的试验，制备了适合本方法开展的直径为15 nm的胶体金颗粒，并最大限度地提高标记的效率。 ③稳定性及重复性好：免疫胶体金的稳定性是影响试剂盒质量的一个重要因素。 免疫胶体金的制备，是金颗粒表面吸附蛋白质以形成牢固结合的过程。 该过程受酸碱度、离子强度、免疫胶体金的浓度、温度等因素的影响，其中主要取决于pH值。 为此，我们优化了胶体金标记的最佳条件和免疫胶体金悬浮的最佳配方，使该试剂保存时间延长。 ④操作简便：本试剂盒的核心部分仅为一个试条，构造十分简单;结果显示为红色的条带，判断非常容易;操作更是方便，不需任何设备，特别适应于中小型医院， 医师诊所和急诊检验，并可在家中测试。 ⑤快速：GICA操作过程一般仅需几分钟，最长不超过10min;而在ELISA操作中，由于涉及加血清、标记物、底物及繁复的洗板等步骤，约需2 h方可完成。

研究表明，CagA阳性Hp感染与上消化道疾病的关系更为密切[7-9]。 来自亚太地区的研究提示，Hp感染者中CagA阳性Hp感染率相当高[10-12]。 为适应大面积的CagA阳性Hp的筛选，本文所建立的检测血清中抗CagA IgG的方法无疑对于CagA阳性Hp感染的快速诊断有重要意义。 由于GICA检测血清标本中抗CagA IgG具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简易快速、无须仪器设备等优点，因而有广泛应用前景。

通讯作者 韩锋产，710033，陕西省西安市长乐西路17号，第四军医大学全军基因诊断技术研究所。

作者简介：韩锋产，男，1963-05-08生，陕西省咸阳市人，汉族。 1985年延安大学医学系毕业，1990年西安医科大学生物化学硕士，1995年第四军医大学生物化学博士，主要从事基因诊断方面的研究工作，发表论文12篇。

Correspondence to:HAN Feng-Chan, Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xilu, Xi&#39;an 710033, Shaanxi Province, China

Tel. +86·29·3374771

Email.Hanfc@263.net

四、参考文献

1 Beggs M, Novotny M, Sampedro S. A selfperforming chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophin(HCG) in urine and serum. Clin Chem, 1990;36:1084-1085

2 Pi GH, He HY, Gu SY, Zhang SX, Deng Y. Detection of serum anti-HCV IgG by gold conjugated immunosorbent assay. Zhonghua Shiyan He Linchuang Bingduxue Zazhi, 1995;9:371-373

3 Zhou JH, Rong GY, Yang SC, Zhang JZ, Cheng Y, Ren JM. Gold immunochromatography assay for the detection of HBsAg. Zhonghua Yixue Jianyan Zazhi, 1998;21:30-32

4 Roe CD, Courtoy PJ, Baudhuin P. A model of protein-colloidal gold iteraction. J Histochem Cytochem, 1987;35:1191-1198

5 Wang BL, Scopsi L, Martvig M, Larsson LI. Simplified purification and testing of colloidal gold probes. Histochemistry, 1985;83:109-115

6 Seno S, Akita M, Hsueh CL. A new method of the immunocytochemical detection of cellular antigens for light and electron microscopy. Histochemistry, 1989;91:449-454

7 Covacci A, Censini S, Bugnoli M, Ptracca R, Burroni D, Macchia G. Molecular characterization of the 128kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90:5791-5795

8 Ching CK, Wong BCY, Kwok E, Ong L, Ccvacci A, Lam SK. Prevalence of CagA-bearing Helicobacter pylori strains detected by the anti-CagA assay in patients with peptic ulcer disease and in controls. Am J Gastroenterol, 1996;91:949-953

9 Crabtree JE, Wyatt JI, Sobala GM, Miller G, Tompkins DS, Primrose. Sestemic and mucosal human responses to Helicobacter pylori in gastric cancer. Gut, 1993;34:1339

10 Maeda S, Ogura K, Yoshida H, Funai F, Ikenoue T, Takahashi M. Major virulence facters, VacA and CagA, are commonly positive in Helicobacter pylori isolates in Japan. Gut, 1998;42:338-343

11 Miehlke S, Kisler K, Kim JG, Figura N, Small SM, Graham DY. Allelic variation in the cagA gene of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States. Am J gastroenterol, 1996;91:1322-1325

12 Pan ZJ, Van der Hulst RWM, Feller M, Xiao SD, Tytgat, Dankert J. Equally high prevalence of infection with cagA-positive Helicobacter pylori in Chinese patients with peptic ulcer disease and those with chronic gastritis-associated dyspepsia. J Clin microbiol, 1997;35:1344-1347