胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种高效广谱抗生素，对多种病原菌有较强的抑制作用，常用于动物各种传染性疾病的治疗。但其在动物肉、奶、蛋等食品中的残留严重威胁人体健康，能引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性。欧盟、美国等许多国家已明确禁止CAP用于生产动物源性食品，并制定了严格的限量标准。加入WTO后，农、兽药残留日益成为各发达国家限制我国农副产品出口的技术壁垒。2002年1月30日，欧盟委员会以从中国进口的虾仁中检出氯霉素为由，发布2002/69/EC决议，禁止中国动物源性食品进口，直接造成我国水产品出口6亿多美元的经济损失。

氯霉素等半抗原（分子量<1000Da）的检测方法，通常采用酶联免疫吸附反应（ELISA）及高效液相色谱（HPLC）及气-质联用（GC-MS）等方法。然而，这些方法需要较长的实验时间及相应昂贵的实验设备，主要被限制在实验室中使用。随着人们对食品安全的日益重视和进出口贸易的高速增长，迫切需要一种能快速、稳定地检测农、兽药残留的方法。胶体金免疫层析试条因其使用方便已被广泛用于小分子物质的诊断检测，目前已经开发出用于链霉素、磺胺嘧啶等农、兽药残留检测的试纸条。本实验开发了一种快速检测氯霉素残留的免疫层析试纸条，具有灵敏度高，操作快捷，不需要附加设备等优点，适用于加工企业对原辅材料验收，人员用药，成品分析以及养殖场对投入品的检测等工作。

一、材料与方法

1、材料 氯金酸（HauCl4·4H2O）、氯霉素标准品、牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000购于SIGMA公司；抗氯霉素单克隆抗体（MAb），购于Biodesign公司（免疫原为KLH与氯霉素的偶联物，鼠源性）；水溶性碳二亚胺（EDC）、氯霉素琥珀酸钠盐，购于Fluka公司；羊抗鼠IgG购于北京鼎国生物技术有限公司；氯霉素ELISA检测试剂盒购于EURO-DIOGNOSTICA公司；Bradford蛋白定量试剂盒购于Bio-Rad公司；BioJet XYZ3000型点膜仪购于美国BioDot公司；硝酸纤维素膜（NC）、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫购于Millipore公司。

2、胶体金的制备及抗氯霉素Mab的金标记 胶体金颗粒的大小平均为30nm，参照文献制备胶体金颗粒，在100ml去离子水中加入1%柠檬酸三钠1ml，煮佛后迅速加入1%氯金酸1ml，继续煮佛10min，冷却后，4℃下保存备用。

取已制备好的胶体金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0.边搅拌边加入抗氯霉素MAb1.5mg，搅拌20min，再逐滴加入2ml25mg/ml聚乙二醇20000（PEG20000），搅拌15min.20000 r/ min离心15min，弃上清液，加入10mlpH7.4PBS缓冲液（含0.4mg/mlPEG）清洗2次。将沉淀用5ml含2%BSA的PBS缓冲液（Ph7.4）溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

3、样品制备 氯霉素标准样品配制 以甲醇配成100μg/ml标准贮液，后以超纯水稀释成各浓度梯度。

肉类样品预处理 取10g均质过的试样，加入10mlPBS，37℃混合保温90 min后，3000r/ min离心20 min，收集上清液备用。

牛奶样品预处理 取5ml新鲜牛奶，放入离心管中，10℃3500r/m离心10 min，吸除上层的脂肪层，取去脂牛奶用PBS适当稀释后备用。

将上述试样处理液与各种浓度的氯霉素标准品按不同体积比混合成所需浓度的试样。

部分实际待测试样的处理方法参考荷兰EURO-DIAGNOSTICA氯霉素检测试剂盒产品试样处理方法。

4、氯霉素全抗原的合成 包被抗原为氯霉素与BSA的偶联物（CAP-BSA），其合成方法为活性酯法及叠氮法，参见文献，其中活性酯法为：先将20mg氯毒素琥珀酸盐、15mgEDC及30mgBSA混合溶于1ml Tris缓冲液中，0~4℃下避光搅拌1h，再加入5mgEDC，在0℃下搅拌反应12h，静置过夜后，后用Tris缓冲液透析3d.

将合成的CAP-BSA全抗原稀释成100μg/ml（蛋白浓度），后做200~300nm波长的紫外扫描，参照杨利国介绍的计算方法测算偶联比，即CAP与载体蛋白BSA的摩尔比。其中BSA浓度以BRADFORD蛋白定量试测定。

用EURO-DIOGNOSTICA公司的ILISA试剂盒检测氯霉素浓度，操作方法参见产品说明书。在450nm波长处测A值，计算抑制率：

抑制率=B/B0×100%

B0为不含待测试样中氯霉素的吸光值，B为含待测试样中氯霉素吸光值。

5、试纸条组装 用点膜机把适当浓度的CAP-BSA及羊抗鼠IgG喷在NC膜上，分别作为检测线（T）和控制线（C），在37℃烘箱干燥8h.以同样方法，将制备好的金标记CAP单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。

试纸条组成为一个PVC背板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用带MARK胶带绕背板覆盖在样品垫、胶体金结合垫及吸水垫上。用切割机将贴好的板切割成3mm宽的条，放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

6、检测方法 将CAP检测试纸条带MARK线的一端插入装有待测试样的容器中，使试样溶液沿膜从下往上移动。5min以后，即可判读结果。

二、结果与讨论

1、检测结果的判读 试纸条的组成如图1所示。当样品垫端放入检测试样时，由于毛细作用液体向前移动。到达T线时，试样中的氯霉素与固定在T线上的CAP-BSA复合物竞争结合抗氯霉素MAb-胶体金复合物，若试样中氯霉素浓度小于1ng/ml，则胶体金结合垫中的抗氯霉素MAb-胶体金复合物与T线上CAP-BSA及C线上羊抗鼠IgG大量结合，T线呈色与c线相近，结果为阴性；若试样中氯霉素的浓度大于1ng/ml，则抗氯霉素MAb-胶体金复合物基本上与检测试样中的氯霉素结合，不能与T线上的CAP-BSA结合，因此T线将比c线浅很多或完全看不到线，而且试样中氯霉素浓度越高T线显色越浅，结果为阳性。如检测正确进行的话，控制线总会显示红色线条。

2、CAP-BSA人工抗原合成 本试纸条检测线所用的包被抗原为CAP-BSA偶联物，由本实验室人工合成。偶联反应后所得产物经紫外光谱分析，参照文献所介绍的方法计算其偶联比率。多次实验所得抗原的偶联比率在1：10~40左右，部分数据见表1.由表1可以看出，BSA与CAP偶联后最大吸收峰都发生蓝移，可能是其分子结构发生变化及环境极性增大的原因。对氯霉素与BSA的偶联是否成功，还采用竞争抑制ELISA检测来判断。按梯度稀CAP-BSA偶联物，后由CAP-BSA与CAP标准品竞争结合氯霉素抗体。

氯霉素标准品对不同浓度CAP-BSA的抑制率，随着CAP-BSA稀释倍数的升高（CAP-BSA含量减少）酶标氯霉素标准品对其的抑制率升高。即CAP-BSA与酶标氯霉素竞争结合氯霉素抗体，表明抗原偶联是成功的。

本实验还对CAP抗原的合成方法采用了活性酯法与叠氮法，并比较其对T线的影响。由于叠氮法合成的叠氮化合物为淡黄色物质，干扰T线显色，因此不适用作为检测线的包被抗原。而活性酯法合成的偶联物CAP-BSA1~3，以相同的BSA浓度包被T线，控制线都能与金标记的CAP抗体反应出现明显的红色线条，适合做包被抗原。并发现其不同结合比对检测的灵敏度有一定影响，见试纸条的调试部分。

3、试纸条的调试 将不同半抗原结合比、不同浓度的CAP-BSA和不同A值的氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物分别包被在硝酸纤维素膜和胶体金结合垫上，反复调试，使最终的灵敏度达到所需的要求。其用量如下：氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物采用A值为40（喷量2μg/cm）的包被量，检测线CAP-BSA用量为0.1mg/ml（喷量0.75μl/cm），控制线羊抗鼠IgG用量为1mg/ml（喷量0.75μl/cm）。

调试结果表明采用不同pH值5、6、7、8、9、10的样品垫对试剂条的灵敏度没有产生明显影响。将硝酸纤维素膜用各种不同配比的溶液做封闭，发现试剂条的C、T线显色都变浅，但对灵敏度和特异性没有明显影响，所以最终制备试剂条时没有采用封闭的方案。经过比较发现，用同样的C、T线浓度、抗体-胶体金复合物A值和同样的包被量，采用12μm和5μm这两种不同比例的蔗糖和海藻糖，会对胶体金复合物从胶体金结合垫上的释放能力产生影响，在一定范围内，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，胶体金复合物释放得越快。

采用半抗原偶联率比较高的CAP-BSA做成的试剂条灵敏度更高，这可能同偶联比率高的CAP-BSA与氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物发生反应的能力更强有关。但过高的半抗原结合比并不符合C、T线颜色对比这种判断，反而使灵敏度下降。

4、本试纸条氯霉素的最低检测水平（LDL）的判断标准是当检测线比控制线的颜色明显淡时，试样中氯霉素的含量为1mg/ml.当试样中的CAP浓度大于5ng/ml时，检测线完全消失；当CAP浓度小于0.5ng/ml时，检测线与控制线在肉眼下没有明显区别。本试纸条的LDL可达到1ng/ml.检测限如再降低，容易出现假阴（阳）性的结果。由于其使用主要是在生产场所现场大批量初筛时定性检测，此灵敏度可以满足实际的筛选需要，如需可靠的定量结果还需在实验室里做ELISA、HPLC等进一步检测。

5、检测的特异性 将氯霉素琥珀酸钠，甲砜霉素，磺胺二甲基嘧啶，四环素，青霉素，链霉素6种抗菌素溶于PBS（pH7.4，0.01mol/L），配成不同浓度，然后用试纸条检测。结果如图3所示，氯霉素琥珀酸钠及氯霉素在低浓度下即不出现红色T线。而后5者（类似物）即使在浓度大于100ng/ml时，也能见明显的T线，可见与不同抗菌素的交叉反应很低（因定性检测不能给出交叉率的确切数值）。由于T线包被抗原是以琥珀氯霉素钠盐偶联BSA而成，因此氯霉素琥珀酸钠与氯霉素的这种交叉反应是在意料之中的。因此免疫层析试纸条可以通过观察试纸条上检测线的有无及颜色变化进行定性检测，对氯霉素具有较高的特异性。

6、稳定性试验 用同一批次不同试纸条检测同一样品，及用不同批次试纸条测定同一样品，其质控线、测试线的显色时间及颜色深浅和最终结果判读基本相同。

利用该试纸条对含不同浓度氯霉素残留的虾肉提取液试样进行检测并与ELISA的检测结果比较，总共检测50份（阳性30份，阴性20）。试纸条以1ng/ml为判断限值，没有出现假阳性及假阴性，检测结果与ELISA结果完全相符。如把检测限值再降低则易出现假阳性的结果，不能达到试纸条检测稳定性的要求。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测（POCT）中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。

目前已有些非临床检测的应用，如毒素、药残留、环境监测等。我们研制的氯霉素胶体金免疫层析检测试纸条可用于饲料、水产类、牛奶等的检测，最低检测含量（LDL）达到1ng/ml.相对于目前使用ELISA方法检测氯霉素样品至少需要24h，费用约为300元/个，试纸条只需10min就可出结果，费用低廉，而且不需要附加实验设备，能满足养殖场所和加工企业对原辅材料、人员用药及产品初筛等的检测需要。但由于实验样品来源有限，检测试纸条的各种参数，需在扩大样品范围与数量条件下做进一步的验证。