电穿孔法进行质体转化步骤

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仪器用具：

37℃培养箱及冰浴

Electroporation cuvette (electrode gap, 0.1 cm)

Electroporator (Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它厂牌)

药品试剂：

无菌水 (置冰浴中)

10% glycerol (置冰浴中)

SOB 液体培养基

SOB 固体培养基

SOC 液体培养基

SOC/Amp 固体培养基

大肠杆菌 JM109

Ligation mixtures

方法步骤：

菌体的处理：

1) 进行转形实验的前16~20 h,将菌种JM109 接种在SOB 固体培养基上，并在37℃培养箱中培养。

34 Methods in Biotechnology Vol 1

2) 取80 mL SOB培养基装入250 mL灭过菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选8 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入80 mL SOB中，于37℃震荡培养约2~3h,直至细胞数约为4~7×107/mL.

3) 收集菌液于离心管中，置冰浴中10 min.

4) 以750~1,000 g 离心12~15 min (4℃)。

5) 倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器 头吸干净。

6) 沉淀加入80 mL 冰冷的无菌水，稍加震荡，混合均匀后以750~1,000 g 离心12~15 min (4℃)。

7) 倒去上清，菌体再依序以40 mL 及1.6 mL 无菌水同法处理。

8) 菌体以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 悬浊。

9) 菌液每80 μL分装一管，可直接用于electroporation,或以液态氮或干冰快速冻结后置 -70℃贮存。

Electroporation:

1) 进行electroporation 的DNA 样品溶液中离子强度不可过高，DNA 需先经过透析或以酒精沉淀处理。透析可如2.3.1 节步骤15) 进行。

2) Cuvettes 自包装中取出后，置冰浴中至少5 min.

3) 将菌液置于冰浴中，加入DNA 样品，混合后，小心将溶液吸至cuvette 的凹槽中，将cuvette 置冰浴中。

4) 进行electroporation 时，将cuvette 由冰浴中取出，将四周水份擦干，置于反应槽中，并接上电极线。

5) 以2.5 kV, 21 μF 进行electroporation.

◆ 注意!高电压!

6) 取出cuvette，立即加入1 mL SOC.

7) 吸出菌液移至微量离心管中，于37℃震荡培养45 min.

8) 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate.置37℃培养16~20 h.

9) 观察plate 上菌落的形状并计算菌落数。