活体电穿孔法介绍

1、什么是活体电穿孔
    活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用,导入动物目标组织或器官.由于这种方法能有效导入外源基因,可在多种组织器官上应用,并且效率较高.活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间, 细胞膜 表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复.在此期间生物大分子如 DNA 可通过这种微小的通道进入细胞.近年来活体电穿孔法用于 转基因 研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法.
    活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况.大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景.因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多.

2、活体电穿孔法的特点
    活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:
    首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官.
    在用于基因治疗方面,要考虑到靶器官组织生理特性.如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题.当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的 表达载体 来选择基因转移和表达的靶器官组织.例如鱼精蛋白21 启动子 可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的 睾丸 作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达.
    其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的 YAC 、BAC 基因组 ,都有成功导入并获得表达的报道.
    此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作.
    但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源 基因表达 持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低.外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异.
    由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达.如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月.

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