mRNA/siRNA转染技术及影响因素

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RNA转染 技术是将RNA分子如mRNA、siRNA、病毒RNA等导入细胞并进行表达的过程。RNA转染技术主要用于研究RNA的功能，其中miRNA的转染已经成功应用于抑制目的基因的表达及其功能研究中。

不同的实验技术都是为了满足不同的实验需要，RNA转染 提供了另一种有别于DNA转染的研究探索手段——直接将体外翻译的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖体利用转染技术带入细胞中。由于不需要经过转录即可直接翻译，RNA转染得到的结果比DNA转染更快更直接，当然仅限于瞬时表达。RNA转染的这些特性很适合某些研究：比如处于非分裂期的细胞转染或者很难用质粒转染的细胞，RNA病毒的研究，反义RNA的转染，siRNA转染(RNA干扰)等等。

影响RNA转染 的因素

既然都是核酸，传统的DNA转染 方法都可以用来转染RNA，不过最头疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。

RNA操作要注意的事项我们就不用罗嗦了，转染 中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，你也要想到人家做质粒DNA转染时往往不会这么小心，难免将污染混入，那你岂不是很冤?多数情况下转染试剂都不建议自己分装，因为不同的管材可能会影响转染试剂的稳定性，那就更得不偿失了。所以RNA专用的转染试剂会更好一些。还有重要的一点就是要采用优质无RNAse污染的血清。

转染时的细胞汇合度常常会比DNA转染高一点，也许是因为RNA转染表达比DNA快?RNA转染的用量必须参考转染试剂说明，因为RNA和转染试剂的比例决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞。RNA少了固然表达不好，太多也会有毒性的问题。有的品牌转染试剂有促核酸凝聚的试剂，帮助核酸折叠为较为致密的结构。如果转染试剂对细胞没有太大影响，转染复合物和细胞共同孵育的时间越长当然越好。不过，如果RNA本身带有荧光标记的化，检测前通常要洗掉多余的RNA以免干扰结果。

除了操作，RNA本身的结构也对转染有一定的影响。哺乳动物的mRNA分子带有5'端帽子结构和3'端PolyA尾巴，此外还有成为IRES(internal ribosomal entry site)的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高mRNA的稳定性，或者有助于核糖体结合到mRNA上进行翻译。对于体外转录得到RNA可以通过实验加入模拟RNA5'端帽子结构类似物而获得这个保护性的“帽子”(Ambion公司有提供的)，3'端PolyA尾巴也可以通过实验添加。多数情况下添加这些元件有助于提高RNA进入细胞后的稳定性。但是有时候IRES元件促进翻译的进行，而到有的细胞株中，由于缺乏相应的结合蛋白，IRES反而影响转录。这个在RNA转染实验设计中是要格外注意的。RNA干扰实验中的siRNA结构对基因沉默效果也有影响，比如推荐添加的AA(N19)TT结构(AA(N21)或者CA(N21)也是可以的)。这就不在转染的讨论范围内了。

RNA转染过程中的影响因素比较多，如RNA的机构、RNA转染时RNA的用量、RNase的污染、进入细胞后RNA的降解等因素使RNA的转染过程更加复杂、给转染结果带来影响，其中RNA在转入细胞后的降解问题在RNA转染过程中是比较重要的，如果转染的RNA在进入细胞体后大量降解，那么实验结果就很不准确了。