siRNA制备方法（how to get siRNA）

In vitro
A. . 化学合成法
Ｂ、体外转录
Ｃ、酶切长链dsRNA
In vivo
Ｄ、载体表达siRNA
Ｅ、PCR合成siRNA表达元件

A. 化学合成法
1.方法简单、快速，需要时间短；获得的siRNA纯度高
2.适用于短期体外实验研究，尤其适用于需要单一siRNA序列的研究
3.siRNA可进行标记
4.需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列
5.不适用于长期研究
6.不适用于siRNA序列的筛选

siRNA序列设计注意事项
1.选择以AA开头的19-21nt长的序列
2.靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束
3.选择 2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验
4.选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。
5.若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好.
6.最后,选择的DNA 片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性
7.设定适当的对照

设置适当的siRNA对照
1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成，但排列完全不同，且不与其它基因由同源性
AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6)
ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6)
2)1-2碱基错配的 siRNA对照 (1-2nt)
AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG
AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A错配

siRNA序列设计
根据文献报道，使用确定的siRNA序列
许多网站提供siRNA设计软件，只需输入靶定基因序列，即可提供候选siRNA序列；比如Ambion公司,武汉晶赛

B、体外转录合成短的siRNA
1.T7 RNA 聚和酶体外转录DNA，直接产生小片断的siRNA，
2.快速、灵活，适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时
3.siRNA可进行标记
4.可重复性差，不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究
( 使用 T7 RNA 聚合酶需要转录的RNA前两个核苷酸为GG or GA 以保证高的合成效率 (Milligan 1987). 在siRNA的5‘ 需要是GG or GA 序列，同时在3’端又需要有两个UU ；这就极大的减少了可能的siRNA的靶位点 这些限制了体外转录作为产生siRNAs稳定的方式)

(体外合成一段目的基因的寡核苷酸（有义链和反义链），其3‘端含有8个碱基与Ｔ７启动子序列互补；将Ｔ７启动子与模板混合，Ｋｌｅｎｏｗ酶补平，使用Ｔ７ＲＮＡ酶进行转录。杂交，消化、纯化 )