MTT的两个用途及原理

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不可不知的细胞检测方法——MTT

mtt 主要有两个用途

1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;

2.细胞增殖及细胞活性测定。

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD 值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

贴壁细胞：

1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS 填充)。

2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS 冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫 检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)

悬浮细胞

1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔)，共 100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640)。

2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4)，直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)

4、离心(1000转x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。

5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。