体外细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏实验方法步骤

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一、实验原理

细胞培养 可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养， 即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高 细胞膜 对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方 法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二、实验方法

材料：

小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS ，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱(4℃、-20℃、-70℃)，液氮 罐，冻存管，冻存液，废液缸等。

方法：

(1)原代培养 ：

1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。

2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。

3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。

4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。

5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清(去除血液等)。

6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。

7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。

面做好标志，注明细胞、组别及日期。然后将培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养。

(2)传代培养 ：

1.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。

2.培养液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围。

3.拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培养液瓶中。

4.打开培养瓶，瓶口过火，将培养瓶内的培养液轻轻倒入废液缸，用2-3mLPBS洗去残留的旧培养基。

5.培养瓶加入0.25%胰酶，用量以薄薄盖满一层为宜，37℃消化，倒置显微镜下观察到细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鲜培养基。

6.取弯头滴管反复吹打细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

7.对半贴壁培养细胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

(3)冻存：

1.吸取传代后的细胞悬液，离心，去除培养液，加入冻存液，分装冻存管(冻存管内细胞数目一般为(5～10)×106个/ml，2ml冻存管中一般放1～1.5ml细胞)。

2.按步冻存

o冷冻保存方法一：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min;当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

o冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长期保存。

(4)复苏：

1.取出冷冻管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，移入无菌操作台内。

2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

4.加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。