DNA的限制性内切酶 酶切实验

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实验目的

1. 学会DNA限制性内切酶 酶切技术。

2. 琼脂 糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。

实验原理

质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列G↓GATCC，用BamHI酶切后形成线性质粒DNA。琼脂 糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小，必须用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是lDNA/EcoRI、lDNA/HindIII、lDNA/EcoRI+HindIII的酶切片段

<center> <img alt="DNA的限制性内切酶 酶切实验" height="278" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590524.jpg" width="448" /></center> <center> <img alt="DNA的限制性内切酶 酶切实验" height="404" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590525.jpg" width="255" /></center>

实验材料和试剂

(一)实验材料

实验二提取的质粒 pUC118

(二)试剂

1.限制性内切酶 BamHI

2.l DNA/HindIII分子量标准

3.双蒸馏无菌水

4.溴酚蓝指示剂点样缓冲液

5.1mg/ml溴化乙锭溶液

6.电泳缓冲液(TAE)

7.0.7% 琼脂糖凝胶(用TAE电泳缓冲液配制)

(三)器材

1.5ml Eppendorf管 200ml吸头

(四)仪器

微量移液器 离心机

恒温水浴锅 电泳仪

水平电泳槽 透射紫外观察仪

实验步骤

1. 取一个灭菌的Eppendorf管，依次加入下列试剂：

双蒸馏无菌水 12ml

10×BamHI缓冲液 2ml

质粒pUC118 5ml

BamHI 1ml

总体积 20ml

2. 用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。

3. 置37℃水浴60～120 分钟。

4. 加入5ml溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果，鉴定酶切效果。

【提示】

实验操作中注意的问题

1. 酶切反应用的Eppendorf管和吸头，都要用新的，用双蒸馏水洗净，灭菌。使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染。

2.DNA样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。

3.要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶。

4.取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。

5.当样品在37℃保温时，要将Eppendorf管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密使水进入管内，造成实验失败。